脑缺血海马caspase非依赖性凋亡相关蛋白表达水平的改变

论文摘要

脑血管病发病率高,严重危害人类健康,是当今第三大死亡原因及首位致残原因。脑缺血/缺氧损伤所致的神经元大量死亡是导致中风后神经功能丧失的主要原因,而目前对缺血性脑损伤的机制仍未阐明,临床也无理想的治疗手段。脑中风可引起缺血中心区神经元的急性损伤,以及缺血半暗区神经元的继发性损伤,即迟发性神经元死亡。迟发性神经元死亡的发生机制主要为凋亡,凋亡是一种高度调节的程序性细胞死亡过程,以往的研究表明,caspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）依赖性机制在这一过程中起重要作用,但最近有越来越多的研究表明casepase非依赖性机制也参与了迟发性神经元死亡。虽然目前对caspase非依赖性细胞凋亡的调节机制尚不明确,但已经发现了一些与caspase非依赖性细胞凋亡相关的分子,如BNIP3,AIF,EndoG,ARPP等。BNIP3（Bcl-2/adenovirus E1B-19K相互作用蛋白3）是一种促凋亡蛋白,属于Bcl-2家族促细胞凋亡亚家族中的BH3-only亚家族,研究表明BNIP3参与了包括上皮细胞,心肌细胞,神经胶质细胞,神经元等多种细胞的死亡过程。内源性BNIP3与线粒体疏松结合,当受到凋亡信号刺激时,BNIP3靠它的跨膜结构域插入线粒体外膜,引起线粒体通透性转换孔（permeability transition pores,PTP）开放,线粒体膜内外电化学梯度降低,氧自由基产生增多,线粒体功能失调,进而导致细胞死亡。BNIP3介导的细胞死亡不依赖于细胞色素C的释放以及Apaf-1,caspase的激活,以早期质膜以及线粒体膜损伤为特点。但BNIP3是否参与大鼠全脑缺血/再灌注损伤中海马神经元的死亡以及引起细胞死亡的机制目前还不清楚。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是目前唯一比较明确的调控BNIP3表达水平的上游信号分子,但目前对于BNIP3引起细胞死亡的下游分子机制还不清楚。AIF与EndoG是已知的线粒体功能障碍的下游分子,参与了caspase非依赖性细胞死亡通路。AIF和EndoG是存在于线粒体内外膜之间的凋亡相关蛋白。当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后,线粒体膜上的PTP打开,允许它们从线粒体释放到胞浆,并转位到核内进而引起DNA的大片段裂解,但AIF本身没有核酶的特性,它的DNA降解作用是通过其它核酶来实现的。EndoG很可能是AIF的相互作用分子。AIF和EndoG参与多种细胞的死亡通路,但其是否是BNIP3诱导细胞死亡的下游分子目前尚不明确。我们首先观察了脑缺血/再灌注后海马BNIP3表达水平的动态变化。采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制做大鼠全脑缺血模型,通过尼氏染色观察海马神经元的存活状况,与假手术组相比,缺血后7天的海马CA1区有大量神经细胞皱缩,胞核碎裂消失,结构不清,证明我们的模型确实引起海马神经元的死亡。通过Western Blot观察了BNIP3在脑缺血/再灌注后不同时间点大鼠海马组织及其线粒体中的表达清况。在缺血/再灌注后不同时间点,假手术组于术后24小时麻醉大鼠,断头取脑,分离海马组织,提取全细胞及线粒体样品。全细胞样品的结果:发现BNIP3单体（30KD）于缺血/再灌注后增加,差别有统计学意义(F（6,14）=5.330,P=0.005);缺血/再灌注后1小时组与假手术组相比增加2.26倍,差别有统计学意义（P＜0.05）;缺血/再灌注后2,6,12小时组增加量分别为假手术组的2.60,2.93,2.61倍,差别有统计学意义（P＜0.01）;BNIP3双聚体（60KD）在缺血/再灌注后表达水平的改变无统计学差异(F（6,28）=0.028,P=0.942)。海马组织线粒体中没有观察到BNIP3单体的表达,而BNIP3双聚体在缺血/再灌注后增加,差别有统计学意义(F（6,28）=2.699,P=0.034)。仅缺血/再灌注后24小时组与假手术组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。BNIP3表达水平的改变提示它可能参与了大鼠脑缺血/再灌注后海马神经元的死亡。最后,通过Western Blot观察AIF和EndoG在脑缺血/再灌注后不同时间点的大鼠海马组织及其线粒体中的表达清况。结果发现在海马组织及其线粒体中,缺血/再灌注损伤后AIF蛋白水平改变均无统计学差异(F（6,21）=1.070,P=0.411;F（6,14）=1.089,P=0.415),而海马组织及其线粒体中的EndoG蛋白水平在缺血/再灌注后均增高,差别有统计学意义(F（6,5.333）=38.831,P=0.000;F（6,5.333）=27.050,P=0.001)。仅缺血/再灌注后24小时组与假手术组比较差别有统计学意义（P＜0.05）。这一结果与预期结果（EndoG核转位后,线粒体中的表达水平应降低）不符,可能是因为EndoG在细胞中表达水平的增高掩盖了其线粒体的核转位,所以EndoG是否发生核转位,还需今后进一步研究其在海马组织细胞核中的蛋白水平的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 论文发表情况
• 致谢