马γ-干扰素单克隆抗体的制备及细胞免疫评价方法的研究

论文摘要

γ-干扰素（IFN-γ）是机体内一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。研究表明,内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态,因此对样本中的IFN-γ进行定量分析对免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等方面都具有极其重要的理论意义和应用价值。然而,迄今没有应用于检测马IFN-γ的单克隆抗体,用以建立相应的检测方法。本研究旨在建立检测马IFN-γ（Equine interferon-γ, EIFN-γ）抗原捕获ELISA、细胞内细胞因子染色（ICS）和酶联免疫斑点试验（ELISPOT）)等方法,从而为监测马机体免疫状态、研究机体感染或免疫过程中的免疫效应及探讨相关免疫机制等提供技术平台。为此,本研究在克隆表达EIFN-γ之后将其免疫小鼠制备了马IFN-γ单克隆抗体,然后分别对其进行生物素和荧光素（FITC）标记制备了生物素标记的马IFN-γ单克隆抗体和FITC标记的马IFN-γ单克隆抗体,在此基础上成功建立了检测EIFN-γ的相关免疫学方法。首先,从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中采用RT-PCR扩增获得含信号肽的马IFN-γ的编码序列,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。然后以从重组质粒pCR-EIFN-γ为模版扩增获得编码马IFN-γ成熟蛋白（mature EIFN-γ, mEIFN-γ）的基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（+）。经PCR、酶切及序列测定后所获得的重组子转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,经IPTG诱导,将其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水泡性口炎病毒（VSV*GFP）作为指示病毒对所表达的EIFN-γ进行抗病毒活性测定。结果表明,mEIFN-γ开放阅读框全长为441bp,编码146个氨基酸;其在大肠杆菌表达系统的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18 ku,且具有免疫反应活性。采用Ni+亲和层析对大肠杆菌表达系统所表达的mEIFN-γ在非变性和变性条件下分别进行纯化,均获得了高纯度的重组马IFN-γ,且该重组蛋白具有抗病毒活性,其活性单位为1×103 AU/mL。将原核表达的重组EIFN-γ免疫BALB/c小鼠（Mus musculus）,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马IFN-γ作为检测抗原进行间接ELISA检测筛选,最终获得12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果表明,所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对EIFN-γ的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,其中4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b和其余3株为IgM,而且所有12株单克隆抗体的轻链均为κ链。将此12株单克隆抗体分别与两个截短表达的重组马IFN-γ蛋白（GST-mEIFN-γ（1-84）和GST-mEIFN-γ（80-146））进行特异性ELISA检测,结果表明,其中有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-γ（1-84）,而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-γ（80-146）发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。而且,其中一株单抗（SB10）具有抑制重组EIFN-γ抗病毒活性作用。将两株识别不同表位的抗马IFN-γ单克隆抗体腹水（A5和SB10）纯化后,对其中一株纯化后的单抗（SB10）进行生物素标记,通过对重组EIFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1μg/mL,检测抗体的工作效价为1: 1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马IFN-γ和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结果表明,此方法检测敏感度达到1ng/mL,特异性良好。利用荧光素FITC对纯化后的抗马IFN-γ单克隆抗体（SB10）进行标记,制备FITC标记的抗EIFN-γ单克隆抗体,然后采用该抗体对马外周血单核细胞进行胞内EIFN-γ单染色,之后进行流式细胞术检测,并且与商品化的FITC标记的抗牛IFN-γ单克隆抗体（CC302）进行对比试验。结果表明,FITC标记的抗EIFN-γ单抗能够有效地应用于刺激后的马外周血单核细胞的胞内染色检测。分别将识别EIFN-γ不同表位的配对单抗作为捕获抗体和检测抗体,对经刺激的马PBMC所分泌的IFN-γ进行ELISPOT检测,从而建立检测马γ-干扰素ELISPOT方法。经过方阵滴定实验确定捕获抗体的包被浓度为1μg/mL,检测抗体的工作浓度为1: 1000。本研究所初步建立的检测EIFN-γ的抗原捕获ELISA、细胞内细胞因子染色及ELISPOT方法,可为监测马机体免疫状态、研究机体感染或免疫过程中的免疫效应及探讨相关免疫机制等提供技术平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 干扰素研究概述
• 1.1.1 IFN-γ的生物合成
• 1.1.2 IFN-γ调节免疫应答
• 1.1.3 干扰素抗病毒机理
• 1.1.4 干扰素的生物学分析方法
• 1.1.4.1 抗病毒活性分析
• 1.1.4.2 抑制细胞增殖活性分析
• 1.1.4.3 免疫调节活性分析
• 1.1.4.4 酶表达和报告基因分析
• 1.1.4.5 产NO分析
• 1.1.5 干扰素的免疫学检测方法
• 1.1.5.1 抗原捕获ELISA（antigen-capture ELISA，AC-ELISA）
• 1.1.5.2 免疫聚合酶链式反应（Immuno-PCR）
• 1.1.5.3 细胞内细胞因子流式细胞术（Intracelluar cytokine flow cytometre, ICC）
• 1.1.5.4 酶联免疫斑点试验（Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISPOT）
• 1.1.5.5 实时荧光定量RT-PCR（Real Time RT-PCR）
• 1.2 酶联免疫斑点试验的研究进展
• 1.2.1 ELISPOT技术发展历史
• 1.2.1.1 底板材质的改进
• 1.2.1.2 检测内容的多样化
• 1.2.1.3 多细胞因子的检测
• 1.2.1.4 数据处理，从手工到自动
• 1.2.2 ELISPOT技术应用与前景
• 1.2.2.1 疫苗研究开发
• 1.2.2.2 临床指导
• 1.2.2.3 基础研究
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及抗病毒活性测定
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 感受态菌种和表达载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 细胞系与病毒
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 pEIFN-γ基因的克隆
• 2.2.3 mEIFN-γ基因扩增与纯化
• 2.2.4 重组表达质粒的构建和鉴定
• 2.2.5 目的蛋白的表达
• 2.2.6 SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定
• 2.2.7 目的蛋白的纯化
• 2.2.8 大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马IFN-γ抗病毒活性的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 pEIFN-γ基因的克隆
• 2.3.2 目的片段mEIFN-γ基因扩增产物分析
• 2.3.3 重组质粒的构建与测序鉴定
• 2.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定
• 2.3.5 重组mEIFN-γ蛋白纯化
• 2.3.6 大肠杆菌和杆状病毒表达重组马IFN-γ抗病毒活性的测定
• 2.4 讨论
• 第三章 马γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性的分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒和细胞系
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要溶液和培养基的配制
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 免疫抗原和检测抗原的制备
• 3.2.2 免疫动物
• 3.2.3 细胞融合
• 3.2.3.1 SP2/0 细胞的制备
• 3.2.3.2 饲养细胞的制备
• 3.2.3.3 脾细胞的制备
• 3.2.3.4 细胞融合操作
• 3.2.4 杂交瘤细胞的筛选与纯化
• 3.2.5 间接免疫荧光试验
• 3.2.6 单抗的表位初步鉴定
• 3.2.7 细胞冻存
• 3.2.8 细胞复苏
• 3.2.9 单克隆抗体亚型的鉴定
• 3.2.10 抗重组马IFN-γ单克隆抗体抑制重组马IFN-γ抗病毒活性作用的鉴定
• 3.2.11 单克隆抗体腹水的制备
• 3.3 结果
• 3.3.1 检测抗原的制备
• 3.3.4 杂交瘤细胞株的获得
• 3.3.2 单抗间接免疫荧光试验
• 3.3.3 单抗的表位初步鉴定
• 3.3.4 单抗亚型的鉴定
• 3.3.5 抗重组马IFN-γ单抗抑制重组马IFN-γ抗病毒活性的鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要溶液的配制
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 实验动物
• 4.2 方法
• 4.2.1 辛酸-硫酸铵沉淀法对单抗初步纯化
• 4.2.2 G蛋白亲和层析法进一步纯化单克隆抗体
• 4.2.3 生物素标记
• 4.2.4 ELISA操作程序
• 4.2.5 ELISA最优反应条件的确定
• 4.2.6 马IFN-γ夹心ELISA标准曲线的绘制
• 4.2.7 ConA、PMA/Ionomycin和人IL-12 和IL-18 刺激马PBMC
• 4.2.8 夹心ELISA检测马PBMC刺激样品
• 4.3 结果
• 4.3.1 单抗的纯化
• 4.3.2 马IFN-γ双抗体夹心ELISA条件的优化
• 4.3.3 马IFN-γ标准曲线及敏感度确定
• 4.3.4 马PBMC刺激样品的ELISA检测
• 4.4 讨论
• 第五章 细胞内细胞因子染色用FITC标记抗马γ-干扰素单抗的研制及应用
• 5.1 材料和仪器
• 5.1.1 材料和试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 单抗的纯化
• 5.2.2 荧光素标记
• 5.2.3 马外周血单核细胞的分离及培养
• 5.2.4 马γ-干扰素胞内染色
• 5.3 结果
• 5.3.1 单抗的纯化
• 5.3.2 马γ-干扰素胞内染色结果
• 5.4 讨论
• 第六章 马γ-干扰素ELISPOT检测方法的初步探索
• 6.1 材料试剂和主要仪器
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 主要设备
• 6.1.3 溶液配制
• 6.2 方法
• 6.2.1 单抗的纯化及生物素标记
• 6.2.2 马外周血单核细胞的分离及培养
• 6.2.3 ELISPOT操作程序
• 6.2.4 ELISPOT最优反应条件的确定
• 6.3 结果
• 6.3.1 单抗纯化和生物素标记
• 6.3.2 ELISPOT反应条件的确定
• 6.4 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历