论文摘要
目的：胶质瘤发生、发展过程中有着众多基因参与其中,它们以复杂的网络形式相互作用,基因是这个网络中最基本的单元。从基因层面上对胶质瘤的研究,对于进一步了解胶质瘤的发病机制、以及疾病进程有着根本上的帮助。研究胶质瘤中某种基因的变化规律,对于提供评估胶质瘤的诊断、预后以及治疗靶点有着重大的意义。通过建立神经突触核蛋白-γ（SNCG）真核表达载体,随后利用SNCG真核表达载体来构建稳定过表达SNCG模型的人胶质瘤U373细胞,从基因、细胞周期及药物干预三个方面,初步探讨过表达SNCG对U373细胞的影响。方法：参照GenBank数据库（NM 003087）,用Primer 5.0软件设计SNCG扩增用引物。随后以质粒pcDNA3-SNCG为模板,应用RT-PCR法扩增SNCG基因,对扩增的DNA片段进行纯化回收,将纯化回收产物与真核表达载体pIRES2-EGFP进行双酶切,经电泳后回收目的条带,用T4 DNA连接酶将目的片段和空载体进行连接,用DH5α感受态大肠杆菌转化,将转化细菌均匀涂布于含卡那霉素50mg/L的LB琼脂平板,37℃倒置培养12h,待长出抗性菌落后挑取单菌落转移至液体培养基中摇动培养。按质粒小提试剂盒说明书提取质粒后,以重组质粒为模板进行质粒PCR扩增鉴定。再用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定。重组菌液送交上海Invitrogen生物公司测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pIRES2-EGFP-SNCG。通过EcoRI、BamH I双酶切及测序鉴定正确后转染至人神经胶质瘤细胞U373,G418筛选建立SNCG稳定转染的U373细胞系。运用免疫荧光以及实时定量PCR（real-time RT-PCR）检测转染后SNCG表达,流式细胞术（FCM）检测SNCG对细胞周期的影响。结果：经RT-PCR验证以及通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点上的通用引物进行双向测序鉴定,DNA测序结果证实重组质粒插入片段SNCG的序列与GenBank公布序列一致,重组SNCG真核表达载体构建正确。即成功构建了pIRES2-EGFP-SNCG真核表达载体,建立稳定转染SNCG的U373细胞系。重组质粒pIRES2-EGFP-SNCG稳定转染U373细胞后,荧光显微镜观察同一视野细胞,可见视野中细胞均呈现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,与未转染U373细胞比较,U373/neo和U373/SNCG细胞的neo mRNA表达均显著升高；U373/SNCG细胞的SNCG mRNA表达水平显著升高,而未转染U373细胞和U373/neo细胞间无差别。与U373/neo细胞相比,U373/SNCG细胞SNCG mRNA表达上调17倍：经紫杉醇（PTX）处理后,U373/SNCG细胞G2/M比例（49±3.6）%较U373/neo细胞（66±1.7）%下降17%（P<0.05）。结论：成功构建了人SNCG真核表达载体,并在U373细胞中稳定过表达,初步证实过表达SNCG可降低抗微管药物诱导的U373细胞有丝分裂期阻滞,为进一步体外研究SNCG在神经胶质瘤侵袭及转移中的功能奠定了基础,以及为胶质瘤的诊断及治疗提供新的思路。在临床上对SNCG作为胶质瘤血清及体液标志物和化疗耐药机制的应用价值进一步进行检验,可能成为控制肿瘤耐药和新型抗肿瘤药物研发的新策略。