心脉通含药血清对心肌细胞氧化损伤时TNF-α和NF-kB表达的影响

论文摘要

目的心肌缺血可严重影响人们的生活质量,发病率和死亡率很高。急性心肌缺血所导致的心肌梗死又是引起充血性心力衰竭的主要原因,所以心肌缺血防治研究具有重大意义。心脉通为中药合剂,具有活血,化瘀功能。临床研究已经表明对缺血性心肌病具有良好的防治作用。其可以抑制损伤性物质的产生,促进保护物质发挥作用。本实验通过观察在H2O2所致的缺血缺氧状态下,心肌细胞中的TNF-α和NF-kB表达情况的影响,从细胞学,分子生物学角度来探讨这两种药物对抗心肌缺血的损伤作用及可能机制。方法用心脉通给大鼠灌胃,腹主动脉取血,制备含药大鼠血清。所培养细胞接种于96孔板、24孔板和6孔板中,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48小时后,将心肌细胞随机分为正常对照组（15%无药大鼠血清+DMEM）,模型组（15%无药大鼠血清+H2O2+DMEM）,心脉通组（15%含药血清+H2O2+DMEM）,去天冬氨酸血管紧张素Ⅰ（des asparticacid angiotensinⅠ,DAng-Ⅰ）组（DAng-Ⅰ+H2O2+DMEM）。在6h后（H2O2终浓度为200μmol/L）倒置相差显微镜观察心肌细胞形态学改变,用MTT法检测各组细胞活力;免疫细胞化学法染色染色,封片,拍照。各标本拍20张照片随机选取10张用Leica对照片的指定区域核转位率进行测量,得到一个平均值作为该标本的核转位率,通过比较各组的核转位率值从而比较各组心肌细胞的NF-kB表达活化情况;按照trizol说明书提取细胞中的总RNA,取2μg总RNA进行RT-PCR扩增（按照RT-PCR说明书进行）,测定比较TNF-α和NF-kB表达。结果1.MTT法检测H2O2所致的氧化损伤及心脉通和血管活性肽的抗损伤作用①.过氧化氢对心肌细胞的损伤作用:正常心肌细胞培养3天后细胞呈梭形或菱形,细胞伸出伪足并交织成网,搏动同步化。H2O2作用6h后,心肌细胞较正常组比较,搏动率下降甚至搏动消失,细胞间的连接断开,细胞伪足回缩或消失,节律欠规整,频率不一致,细胞折光性差。MTT显示:正常组,模型组OD值分别为0.409±0.090,0.223±0.054。②.心脉通含药大鼠血清和DAng-Ⅰ抗心肌细胞损伤作用:含药血清组与模型组比较,心肌细胞的状态有所改善,伪足回缩不明显,搏动节律较规整,细胞折光性较好。MTT显示:H2O2+DAng-Ⅰ组,H2O2+心脉通组OD值分别为0.298±0.041,0.301±0.025。两药物组OD值明显高于模型组组,相比也具有统计学意义。两药物组相比没有统计学意义。2.NF-kB的表达（免疫细胞化学法染色和图像分析）NF-κB核转位:正常心肌细胞,NF-κB主要表达于细胞浆,其核转位率为:3.925±1.246;其它组心肌细胞在H2O2作用6h后,模型组的NF-κB大部分转移到细胞核,胞浆表达减少,核转位率为46.546±5.163,心脉通含药血清组和DAng-Ⅰ组心肌细胞中NF-κB主要表达于细胞浆,部分在核周表达,核转位率分别为31.124±5.582和33.977±3.925。正常组核转位率明显低于其他各组,模型组核转位率明显高于各用药组,相比也具有统计学意义,H2O2+DAng-Ⅰ组和H2O2+心脉通组相比没有统计学意义。3.RT-PCR法测定（比较）TNF-αmRNA和NF-kBmRNA的表达正常组心肌细胞有一定量的NF-kBmRNA的表达,而模型组中有NF-kBmRNA的表达较正常组明显增多且具有统计学意义（P＜0.05）。心脉通组和活性肽组心肌细胞中的NF-kB mRNA的表达较模型组明显减少,且具有统计学意义（P＜0.05）。两药物组之间比较无统计学差别。TNF-αmRNA在正常组中几乎不见表达,在模型组有明显增多,说明H2O2所致的氧化损伤引起了心肌细胞中TNF-αmRNA的大量表达;各药物组的TNF-αmRNA表达较模型组少（P＜0.05）,DAng-Ⅰ组和心脉通组相比没有统计学意义（P＞0.05）。本实验提示DAng-Ⅰ和心脉通通过抑制TNF-αmRNA和NF-kBmRNA的表达而对抗H2O2所致的氧化损伤,从而达到保护受损心肌的目的。结论（1）过氧化氢确能对乳鼠心肌细胞造成氧化损伤。（2）心脉通含药血清具有抗过氧化氢诱导的心肌细胞损伤作用,可减轻细胞活力的下降,明显改善细胞的形态。（3）NF-κB、TNF-α的激活是过氧化氢诱导心肌细胞氧化损伤的重要机制。（4）心脉通含药血清可能通过抑制NF-κB、TNF-α的激活而发挥其抗过氧化氢导致的心肌细胞氧化损伤的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 主要简略语中英文对照表
• 前言
• 2O₂致心肌细胞损伤作用'>第一部分 心脉通含药血清抗H₂O₂致心肌细胞损伤作用
• 1.原代培养
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要设备和器材
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 主要试剂配制方法
• 1.2.2 消毒
• 1.2.3 心肌细胞培养
• 1.2.4 心肌细胞a-sarcomeric actin的免疫细胞化学染色
• 2O₂所致的氧化损伤及心脉通和血管活性肽的抗损伤作用'>2.H₂O₂所致的氧化损伤及心脉通和血管活性肽的抗损伤作用
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要设备和器材
• 2.1.3 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 试剂的配制
• 2.2.2 心脉通胶囊含药血清的制备
• 2.2.3 DAng-I的配制
• 2.2.4 原代心肌细胞的培养并接种
• 2O₂终浓度的筛选'>2.2.5 H₂O₂终浓度的筛选
• 2.2.6 MTT法检测各组心肌细胞的细胞活力
• 2.2.7 统计学处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 CMC的形态学观察
• 2.3.2 数据分析
• 3.论讨
• 3.1 心肌细胞培养技术:
• 3.2 中药血清药理学方法应用意义
• 3.3 心肌细胞氧化应激损伤模型
• 3.4 心脉通、血管活性肽对心肌损伤的保护作用
• 2O₂致心肌细胞氧化损伤机制的探讨'>第二部分 心脉通含药血清抗H₂O₂致心肌细胞氧化损伤机制的探讨
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要实验仪器和设备
• 4.1.3 实验动物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 试剂的配制
• 4.2.2 免疫细胞化学方法对NF-κB核转位率的检测
• 4.2.3 RT-PCR法测定比较TNF-α和NF-kB表达
• 4.2.4 统计学处理
• 4.3.实验结果
• 4.3.1 免疫细胞化学方法对NF-κB核转位率的检测
• 4.3.2 RT-PCR检测细胞中NF-kB和TNF-α mRNA的表达
• 4.4 讨论
• 第三部分 实验小结
• 参考文献
• 附图
• 附录
• 致谢