论文摘要
Cyclin D1作用于G1期的重要的细胞周期蛋白,可以促进G1/S期转换而加速细胞周期过程。CyclinD1的异常表达与多种肿瘤的发生、发展相关。Cyclin D1经选择性剪切后可得到的一种编码特殊的异构体cyclin D1b。细胞增殖与细胞凋亡是相互协调,共同维持细胞数量的相对稳定,不至于细胞数量过度增减。细胞凋亡是一个多分子多基因参与的复杂过程,其中Bcl-2家族成员在凋亡调控起着重要作用,成员Bcl-2和Bcl-xL等,抑制肿瘤细胞凋亡;成员Bax和Bid等,则促进肿瘤细胞凋亡。Bcl-2与Bcl-xL主要调节线粒体内外膜之间基质的pH值,维持跨膜电位的稳定,保持线粒体膜的完整性;Bax与在mRNA水平表达的则可降低跨膜电位,破坏线粒体膜的稳定性,促进细胞色素C释放。因此,两组分子的表达水平的高低及其两者间的比例决定了肿瘤细胞对凋亡信号的倾向性。肿瘤细胞向邻近部位侵袭和远处转移是影响治疗效果及判断愈后的重要因素。肿瘤细胞侵袭和转移灶的形成与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质和基底膜的能力密切相关,肿瘤细胞分泌的MMPs中,MMP-2明胶酶和MMP-9明胶酶是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障。肿瘤细胞表达αvβ3与胞外基质的相互结合后,活化的MMP-2与MMP-9的释放显著增强,影响肿瘤细胞的浸润转移等生物行为。Sydencan-1通过分子表面的硫酸肝素侧链可结合细胞粘附分子和基质成分等,以共受体方式影响αvβ3的活性调节肿瘤细胞与细胞基质间的相互作用;α5β1能够影响的αvβ3功能,sydencan-4能够协同α5β1提高这一功效,促进细胞间的黏附。Cdc2是αvβ3整合素的下游效应分子。Cdc2表达上调后,主要通过与cyclin B2形成共同因子,作用下游caldesmon,影响细胞内骨架系统的功能,进而促进肿瘤细胞的迁移。HoxD3是重要的转录调控因子之一,HoxD3的过度表达可以上调整合素αv、α4、aIIb和β3等的表达,影响肿瘤细胞和细胞基质间的黏附。Cyclin D1b是否具有和cyclin D1a促进G1/S期转换而加速细胞周期进程一样的作用?Cyclin D1b是否影响肿瘤细胞的预后?Cyclin D1a和cyclin D1b是否影响肿瘤细胞的侵袭和转移?本实验构建重组基因质粒cyclin D1a/b,并转染至MCF-7人源乳腺癌细胞和BCL-7402人源肝癌细胞中,形成稳定表达cyclin D1a/b的新细胞株。研究cyclin D1a/b对肿瘤细胞的增殖和细胞凋亡的作用,并观察cyclin D1a/b在肿瘤细胞的侵袭能力、穿透能力和黏附能力改变,探讨其作用机制。方法:1.取对数生长MCF-7细胞的pcDNA3.1亚株、pcDNA3.1-cyclin D1a亚株、pcDNA3.1-cyclin D1b亚株;BCL-7402细胞的pcDNA3.1亚株、pcDNA3.1-cyclin D1a亚株、pcDNA3.1-cyclin D1b亚株,进行MTT检测。MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞,进行CFSE标记实验,72 h流式检测MCF-7细胞和BCL-7402细胞增殖代数情况。2.MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞接种于6孔板中,每孔中加入25μg/ml丝裂霉素。24 h后,AnnexinV/PI标记,采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。取MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞1×106,进行RT-PCR检测Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bid基因在mRNA水平上表达的变化情况。3.在裸鼠的右乳垫下接种MCF-7三亚株细胞,接种后第20天、第30天、第45天和第60天测肿瘤瘤体的大小;接种后第30天和第60天处理裸鼠,称取瘤重。裸鼠肝内接种BCL-7402三亚株细胞,接种后第30天和第60天处理裸鼠,称取瘤重。4.收集MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞接种于培养皿中,平皿划痕,24 h后,镜下观察肿瘤细胞向划痕处侵袭生长的情况。MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞分别加入Transwell上室,48 h后,计数迁移至下室中的细胞数。MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞培养2 h后,LDH检测黏附至经FN包被过的96孔板上的细胞量。5.在裸鼠的右乳垫下分别接种MCF-7三亚株细胞和裸鼠肝内接种BCL-7402三亚株细胞,接种后第30天和第60天处理裸鼠,取肺脏、肝脏、血液、淋巴、肾脏、胃脏、皮肤和骨髓等组织进行RT-PCR检测在裸鼠组织中cyclin D1a/b mRNA的表达情况。同时,组织取样进行HE染色和免疫组化检测。6.ECM刺激24 h后的肿瘤细胞和未经ECM刺激的肿瘤细胞,进行明胶酶活性的检测。Real-time PCR检测肿瘤细胞中αv、β3、syndecan-1和syndecan-4 mRNA的表达情况;采用流式细胞术检测αvβ3肿瘤细胞膜表达情况,western blot检测肿瘤细胞内syndecan-1和syndecan-4蛋白表达情况。Real-time PCR检测ECM刺激24 h和ECM未刺激的肿瘤细胞内cdc2 mRNA表达情况和western blot检测cdc2蛋白表达情况。免疫共沉淀方法检测肿瘤细胞HoxD3结合cyclin D1的情况。结果:1.MTT检测结果表示,在MCF-7细胞和BCL-7402细胞中,cyclin D1a组与pcDNA3.1组和cyclin D1b组比较,能明显促进细胞增殖。CSFE标记结果表示,在MCF-7细胞和BCL-7402细胞中,cyclin D1a组与pcDNA3.1组和cyclin D1b组比较,能明显促进细胞增殖;cyclin D1b能促使特定的一小群细胞以更快的速度增殖。2. MCF-7细胞,cyclin D1a组、pcDNA3.1组和cyclin D1b组肿瘤细胞的凋亡率分别为:19.92%,17.18%,15.84%;三组间细胞的凋亡没有明显的差别。BCL-7402细胞,cyclin D1a组、pcDNA3.1组和cyclin D1b组肿瘤细胞的凋亡率分别则是:34.77%,29.55%,22.52%,cyclin D1b组与pcDNA3.1组相差12.25%。在丝裂霉素诱导的细胞作用24 h后,BCL-7402细胞中的cyclin D1b组,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达增加;MCF-7细胞中,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达在三组间没有变化;抗凋亡基因Bcl-xL,促凋亡基因Bax和Bid mRNA的表达在丝裂霉素作用前后,并没有明显的改变。在BCL-7402细胞中,抗凋亡基因Bcl-2参与cyclin D1b促进细胞抵抗丝裂霉素诱导细胞凋亡的机制。3.在第30天和第60天,右乳垫下接种MCF-7细胞的裸鼠和肝内接种BCL-7402细胞裸鼠的瘤重,cyclin D1a组保持较快的增长速度,与pcDNA3.1组、cyclin D1b组比较有显著性差异,cyclin D1b组瘤重与pcDNA3.1组重,但两者差异不明显。4.肿瘤细胞黏附实验结果表示,cyclin D1b组肿瘤细胞的黏附能力强;肿瘤细胞划痕实验表示,cyclin D1b组肿瘤细胞的侵袭能力强;Transwell实验进一步证实了cyclin D1b组肿瘤细胞的穿透能力强的结果。5.在裸鼠体内接种MCF-7细胞和BCL-7402细胞实验中,第30天和第60天在cyclin D1b组裸鼠在肺脏和淋巴组织RT-PCR检测到cyclin D1b的表达,第60天HE染色和免疫组化的结果进一步证实,cyclin D1b组在裸鼠肺脏组织有微小转移灶的形成。第90天,cyclin D1b组在裸鼠肺脏组织有肉眼可见转移灶的形成。6.明胶酶活性的检测结果表示,ECM未刺激后24 h MCF-7三亚株细胞和BCL-7402三亚株细胞proMMP-2/9和active MMP-2/9酶活性没有明显的差异。ECM刺激MCF-7细胞pcDNA3.1组proMMP-2/9和active MMP-2/9酶活性较cyclin D1a组和cyclin D1b组酶活性都要弱;cyclin D1a组active MMP-9较cyclin D1b组酶活性都要弱;cyclin D1a组proMMP-2酶活性较cyclin D1b组酶活性都要强。BCL-7402细胞cyclin D1a组proMMP-2/9和active MMP-2/9酶活性较pcDNA3.1组和cyclin D1b组酶活性都要弱;cyclin D1b组proMMP-2/9和active MMP-2/9酶活性较cyclin D1a组酶活性都要强。MCF-7细胞和BCL-7402细胞中的cyclin D1b组都上调细胞膜上的αvβ3表达,但是上调的幅度不是很显著,αv mRNA水平的表达上调cyclin D1a组与pcDNA3.1组和cyclin D1b组比较都明显,β3 mRNA水平的表达上调cyclin D1b组与pcDNA3.1组和cyclin D1a组比较都明显。Western blot检测结果提示,ECM未刺激24 h MCF-7细胞和BCL-7402细胞cdc2 mRNA水平的表达和蛋白水平的表达上调cyclin D1a组与pcDNA3.1组和cyclin D1b组比较都要明显;ECM刺激24 h MCF-7细胞和BCL-7402细胞cdc2 mRNA水平的表达和蛋白水平的表达上调cyclin D1b组与pcDNA3.1组和cyclin D1a组比较都明显。MCF-7细胞和BCL-7402细胞sydencan-1的mRNA水平的表达和蛋白水平的表达上调较cyclin D1b组的pcDNA3.1组和cyclin D1a组都要显著,sydencan-4的mRNA水平的表达和蛋白水平的表达较pcDNA3.1组、cyclin D1a组和cyclin D1b组没有明显的差异。免疫共沉淀结果提示,在MCF-7细胞cyclin D1b组中,cyclin D1和HoxD3共沉淀的蛋白较cyclin D1a组和pcDNA3.1组明显。结论:在体内体外实验中,cyclin D1a作用于G1期重要的细胞周期蛋白,促进G1/S期转换而加速细胞周期过程,促进肿瘤细胞的增殖和生长;cyclin D1b参与促进肿瘤细胞的增殖生长,能促进肿瘤细胞抵抗凋亡产生。HoxD3作为核内重要的转录调控因子之一,Cyclin D1b有可能是通过HoxD3而上调转移相关基因,如增加细胞膜上的αvβ3表达和sydencan-1表达,增强对细胞间的黏附作用。而αvβ3表达上调后,接受ECM分子刺激信号而上调cdc2的表达,进而影响细胞骨架,促使肿瘤细胞迁移;并增加活化MMP-2/9明胶酶释放,降解细胞外基质和基底膜,致使肿瘤细胞远处转移。