论文摘要
研究背景：已知动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病。单核细胞是AS血管病变部位最为重要的炎性细胞之一，单核内皮细胞黏附是AS血管炎症反应的始动环节。非对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一种内源性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂，它能竞争性抑制NOS活性，减少一氧化氮（nitric oxide，NO）生成。新近的观点认为ADMA除抑制NO合成以外，还可能是一个新的致炎因子。活性氧（reactive oxygen species，ROS）／核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号途径是参与炎症反应调控的重要信号系统，在AS发生发展中起重要作用。新近研究证明，在培养的内皮细胞，ADMA能激活内皮细胞内ROS／NF-κB途径，增加单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattract protein-1，MCP-1），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达，促进单核内皮黏附。然而在单核细胞，研究ADMA是否能促进炎症因子表达和单核内皮黏附，目前尚无报道。皂苷C（reinioside C，RC）是从天然药物水莲皂苷中提取的主要单体成份之一。已有的药理实验表明，水莲皂苷具有显著的抗炎活性，但其具体的抗炎成分及机制尚不明确。因此，本课题拟在培养的单核细胞，观察ADMA的致炎作用以及细胞内信号转导途径；在此基础上，进一步探讨皂苷C抑制ADMA诱导的炎症反应的作用及机制。方法：实验分两部分：第一部分：在单核细胞（human monocytoid cells，THP-1），研究ADMA致单核内皮黏附及其机制。实验分组：（1）用不同浓度的ADMA（3，10，30μM）培养单核细胞24 h，细胞计数法观察单核内皮黏附；（2）用不同浓度的ADMA（3，10，30μM）培养单核细胞不同时间（6-48 h），ELISA法检测单核细胞培养上清液中TNF-α和sICAM-1的水平；（3）30μM ADMA培养单核细胞不同时间（1-4h）检测单核细胞内ROS水平（荧光法）和NF-κB活性（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA法）。第二部分：皂苷C对ADMA诱导的单核内皮黏附的影响及其机制。实验分组：（1）30μM ADMA培养单核细胞24 h，并加入不同浓度的皂苷C（1-10μM）、L-精氨酸（0.5 mM）和PDTC（10μM）预处理1 h，观察单核内皮黏附，并收集上清液，检测TNF-α和sICAM-1的水平；（2）30μM ADMA培养单核细胞2 h，并加入不同浓度的皂苷C（1-10μM）、L-精氨酸（0.5 mM）和PDTC（10μM）预处理1 h，检测单核细胞内ROS水平和NF-κB活性。结果：第一部分：ADMA促进单核内皮黏附及其机制研究1．ADMA（10和30μM）呈浓度依赖性地促进单核内皮黏附，升高上清液中TNF-α和sICAM-1水平，且差异具有统计学意义；30μM ADMA培养单核细胞12，24或48 h呈时间依赖性地升高单核细胞培养上清液中TNF-α和sICAM-1水平，预先给予L-精氨酸（0.5 mM）（NO供体）和PDTC（10μM）（细胞内抗氧化剂）可显著抑制上述效应，且差异具有统计学意义。2．ADMA（30μM）培养单核细胞不同时间（1-4 h）呈时间依赖性地升高细胞内ROS水平，激活单核细胞NF-κB，预先给予L-精氨酸（0.5 mM）和PDTC（10μM）可显著抑制上述效应，且差异具有统计学意义。第二部分：皂苷C抑制ADMA诱导的单核内皮黏附及其机制1．皂苷C（1，3，10μM）可呈浓度依赖性地抑制ADMA诱导的单核内皮黏附及TNF-α和sICAM-1表达，预先给予L-精氨酸（0.5 mM）和PDTC（10μM）也有类似的抑制效应，且差异具有统计学意义。2．皂苷C（1，3，10μM）可呈浓度依赖性地降低抑制ADMA所致细胞内ROS水平升高及NF-κB激活，预先给予0.5 mM的L-精氨酸和10μM PDTC也有类似的抑制效应，且差异具有统计学意义。结论：1．在培养的单核细胞，ADMA可增加单核内皮黏附，该作用可能与激活单核细胞内ROS／NF-κB途径，促进炎症分子TNF-α与sICAM-1表达有关。2．皂苷C可抑制ADMA所诱导的单核内皮黏附，该作用可能与抑制单核细胞内ROS／NF-κB途径，降低TNF-α与sICAM-1水平有关。
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