青岛文昌鱼p23基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析

论文摘要

p23蛋白作为热激蛋白90（Hsp90）的辅助分子伴侣（cochaperone），在真核细胞内对许多重要的调控因子和信号蛋白具有调节作用。文昌鱼（Amphioxus）是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究脊椎动物进化的珍贵材料。利用分子生物学手段和生物信息学方法，研究文昌鱼p23基因的结构、进化和表达，可以揭示文昌鱼p23基因与无脊椎动物和脊椎动物p23基因之间的相互关系及其表达模式的异同，有助于从分子水平上阐释脊椎动物的起源和进化。本文从青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）肠cDNA文库（本实验室保存）中，克隆了具有完整编码框的p23基因（AmphiP23），并对其结构、表达和进化展开了研究。AmphiP23全长1455bp，编码170个氨基酸组成的蛋白。该蛋白在氨基酸水平上与人、小鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼、海鞘、果蝇、线虫等的p23蛋白的相似性为25.3％-34.7％，与人的tsp23相似性为21.2％，且具有典型的p23保守域（8-114残基）和p23蛋白共有的保守残基（8W，79K，86W，89L，106W，人的氨基酸序号）。系统进化分析发现，无脊椎动物和脊椎动物p23蛋白分化为两个组群，而Amphip23介于脊椎动物和无脊椎动物p23蛋白之间，说明脊椎动物和无脊椎动物p23基因是在5.5亿年前由共同的祖先分化而成。人tsp23蛋白位于脊椎动物进化枝的基部，说明tsp23可能比脊椎动物p23蛋白更原始，脊椎动物p23和tsp23可能是由类似于文昌鱼AmphiP23基因发生了基因倍增形成的。 Northern blot结果表明，AmphiP23在文昌鱼成体组织中广泛表达（包括脊索、鳃、肌肉、肠、精巢和卵巢），相反，人p23在小鼠表达于除心脏和骨骼肌之外的所有组织（肝、肾、肺、胸腺、卵巢、脾和胃），而人tsp23基因的表达则仅限于心脏和骨骼肌，这种人p23和tsp23在小鼠的互补表达图式与Amphip23广泛表达可能说明，p23在发生基因倍增形成p23和tsp23之前，是广泛表达，而到脊椎动物出现两个基因和功能上的分化。原位杂交分析表明，AmphiP23在文昌鱼早期神经胚的近轴中胚层、脊索和神经管开始表达，随着神经胚的发育，

论文目录

• 独创声明
• 学位论文版权使用授权书
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 发育生物学和进化生物学研究的模式动物-文昌鱼
• 2 分子伴侣p23蛋白的研究进展
• 3 主要内容和技术路线
• 第二章 青岛文昌鱼AmphiP23基因的特征、表达和进化分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 文昌鱼肠cDNA文库的构建与测序
• 2.2.2 序列比较与系统进化分析
• 2.2.3 Nortern blot
• 2.2.4 文昌鱼胚胎p23基因的整体原位杂交
• 3 结果
• 3.1 文昌鱼p23 cDNA的确定和序列分析
• 3.2 文昌鱼p23蛋白的进化分析
• 3.3 文昌鱼p23基因在成体组织中的表达
• 3.4 整体原位杂交技术检测p23基因在文昌鱼不同发育时期的时空表达
• 4 讨论
• 第三章 青岛文昌鱼p23蛋白的融合表达、纯化、鉴定和多克隆抗体制备
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2感受态细胞的制备'>2.2.2 CaCl₂感受态细胞的制备
• 2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.4 重组质粒pGEX-6P-1-P23的筛选
• 2.2.5 重组质粒pGEX-6P-1P23的提取和酶切鉴定
• 2.2.6 重组质粒pGEX-6P-1P23的序列测定
• 2.2.7 重组p23基因在大肠杆菌中的融合表达
• 2.2.8 重组GST-p23融合蛋白的纯化
• 2.2.9 p23融合蛋白的鉴定
• 2.2.10 多克隆抗体的制备及纯化
• 2.2.11 抗体的特异性和文昌鱼体液的Western blot检测
• 2.2.12 文昌鱼p23蛋白的免疫组织化学检测
• 3 结果
• 3.1 p23基因的PCR扩增
• 3.2 pGEX-6P-1-p23表达载体的构建
• 3.3 重组pGEX-6P-1-p23在大肠杆菌中的表达
• 3.4 GST-p23融合蛋白的纯化
• 3.5 p23蛋白的多克隆抗体制备及Western blot检测
• 3.6 文昌鱼p23蛋白的免疫组织化学分析
• 4 讨论
• 第四章 文昌鱼p23蛋白的生物信息学分析及三维结构的同源模建
• 1 前言
• 2 研究方法
• 2.1 文昌鱼p23蛋白序列的生物信息学分析
• 2.2 文昌鱼三维空间结构的同源模建
• 3 结果
• 3.1 文昌鱼p23蛋白的生物信息学分析
• 3.2 文昌鱼p23蛋白的同源模建
• 4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 发表论文
• 作者简介
• 致谢