论文摘要
流行病学调查和动物实验都证明,妊娠糖尿病或孕期持续性高血糖可引起胚胎发育畸形,神经管畸形的发生率最高,但对其发生机理的研究报道甚少,因而对于妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形的发生机理至今尚不很清楚,由发生机理为基础的预防和治疗方面的研究也受到了极大限制。本文在国家自然科学基金和山东省自然科学基金的支持下,对妊娠糖尿病引起胚胎神经管畸形的发生机理进行了比较深入的研究。实验分为三个部分进行:第一部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形的动物模型的建立:以小鼠为实验动物,用腹腔注射链脲霉素的方法将雌性小鼠制成糖尿病鼠。将雌性糖尿病小鼠与雄性健康小鼠合笼交配,孕11.5天时剖腹取胎,解剖显微镜下检查胚胎神经管畸形的外部表征;经固定、切片、染色后,光镜下检查神经管畸形的内部表征。结果发现,糖尿病孕鼠的胚胎中有16%左右神经管未闭合并出现神经管畸形的外部表征,而正常孕鼠同龄胚胎的神经管几乎全部闭合。第二部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形发生机理的在体实验:在成功建立了妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形动物模型的基础上,本部分进行了发生机理的在体实验。神经管是中枢神经系统脑和脊髓的原基,神经组织来自神经管壁上的神经上皮,神经细胞和神经胶质细胞由神经上皮细胞即神经上皮干细胞增殖分化而来。在脑和脊髓的发育过程中,既有神经上皮干细胞的有序增殖,也有神经上皮干细胞的有序凋亡,这种有序的细胞增殖和凋亡不仅受着特定基因时空有序表达的调控,也受着环境因素的影响。神经管发育相关基因的突变或表达异常,环境有害因素的出现,都会引起神经上皮干细胞增殖和凋亡过程的异常变化,从而导致神经管畸形的发生。本实验应用原位末端标记、BrdU标记、DAPI染色等技术方法,检测了糖尿病孕鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的增殖和凋亡状况。实验结果显示:糖尿病孕鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的增殖数目明显低于正常对照组,差异十分显著（P＜0.01）;细胞凋亡数明显高于正常对照组,差异十分显著（P＜0.01）。第三部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形发生机理的体外实验:本课题第二部分的在体实验的结果显示,神经上皮干细胞的过度凋亡和增殖受阻是糖尿病致胚胎神经管畸形的重要机制。但是,胚胎神经管的神经上皮干细胞的增殖和凋亡过程受到胚胎和母体内多种因素的影响,高血糖只是其中一个影响因素。为了排除高血糖之外其它因素可能的影响,我们进行了体外实验,利用体外培养神经上皮干细胞的方法,检测高浓度糖这一单一因素对细胞增殖和分化的影响。具体做法是:将神经干细胞分别培养于生理糖培养基和高糖培养基中,为排除高糖培养基所引起的渗透压变化的影响,还设立了与高糖培养基等渗但有效葡萄糖浓度仍为生理糖浓度的对照组。应用BraU标记方法测定了培养细胞的增殖情况,用MTT法检测了培养细胞的代谢和增殖活性,用原位末端标记（TUNEL）方法检测了培养细胞的凋亡情况,用Western blot技术检测了凋亡相关基因Caspase-3的活化情况。实验结果显示:高糖培养下的神经干细胞,与生理糖浓度培养下的神经干细胞相比:①其BrdU阳性细胞数明显减少,差异十分显著（P＜0.01）,且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可抑制神经干细胞的增殖;②MTT检测的OD值明显降低,差异十分显著（P＜0.05）,且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可降低神经干细胞的代谢和增殖活性;③原位末端标记检测的细胞凋亡数明显增多,差异十分明显（P＜0.01）,且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可导致神经干细胞过度凋亡;④Western blot检测到活化的Caspase-3的表达量明显增多,并与作用时间成正相关,表明高浓度糖引起的神经干细胞过度凋亡是通过激活Caspase-3而实现的。综合上述三个部分的实验可以得出如下结论:妊娠糖尿病可引起胚胎神经管畸形,高血糖的这种致畸作用是通过抑制神经上皮干细胞的增殖和代谢、促进神经上皮干细胞的凋亡而实现的。