骨质疏松症中骨骼肌线粒体的功能变化及机制研究

论文摘要

目的:从线粒体的角度探讨骨骼肌与骨质疏松的关系,以期为骨骼肌作为治疗靶点提供客观合理的量化依据,同时为中医“肾主骨、脾主肌、脾肾相关”理论治疗骨质疏松症提供科学的依据。方法:一、临床实验选择自2008年5月到2008年12月期间在广州中医药大学第一附属医院因腰椎间盘突出或者腰椎管狭窄症需要行手术治疗的女性骨质疏松患者13例,另选同时期需上述手术治疗的女性非骨质疏松患者13例,总共26例。于术中收集肌肉组织,提取骨骼肌线粒体,进行细胞色素C氧化酶和线粒体通透转换孔的活性检测,并进行相关性分析;二、动物实验选择雌性未孕的SD大鼠52只,按随机数字表法分为手术组36只,空白组16只,手术组行双侧卵巢切除,空白组不切除卵巢。术后3个月,从两组中分别随机选取6只大鼠,进行骨密度检查。在确定造模成功后,将手术组剩下的36只大鼠再随机分为3组,每组10只,分别为模型组、雌激素组、中药组。空白组中剩下的10只大鼠为空白对照组。各组进行灌胃给药治疗,灌胃给药容积为10ml/kg,空白组、模型组灌服蒸馏水;中药组给予中药按4.8g/kg灌胃（相当于临床剂量的10倍）,药物以蒸馏水定容至所需浓度,即10ml/kg灌服给药,每日一次;尼尔雌醇组给予尼尔雌醇1mg/kg灌胃,使用前配成混悬液（浓度为0.167mg/ml）,1次/周,其余时间给予蒸馏水10ml/kg灌胃。治疗3个月后,收集肌肉组织进行细胞色素C氧化酶、线粒体活性氧和线粒体通透转换孔的活性检测。结果:一、临床实验,①在线粒体通透转换孔在0 min和30 min的OD值比较中,非骨质疏松组在0 min的OD值为0.182±0.047,而在30 min的OD值为0.181±0.046;骨质疏松组在0 min的OD值为0.143±0.071,而在30 min的OD值为0.141±0.071。随着时间的推移,两组的OD值均呈下降的趋势,30 min的OD值与0 min比较,有统计学意义（P＜0.05）,表明线粒体通透孔的活性增强;但两组在同一时间点比较,无统计学意义P＞0.05)。②在线粒体通透转换孔活性变化的比较方面,非骨质疏松组的OD比值为0.994±0.007,而骨质疏松组为0.985±0.006,两者比较,有统计学意义（P＜0.05）。③在线粒体细胞色素C氧化酶的活性比较方面,非骨质疏松组为0.338±0.142,骨质疏松组为0.124±0.093,两者比较,有统计学意义（P＜0.05）。④在线粒体通透转换孔与细胞色素C氧化酶的相关性分析中,线粒体通透转换孔的OD比值与细胞色素C氧化酶的活性存在着正相关的关系（r=0.405,P=0.04＜0.05）,回归方程如下:Y（细胞色素C氧化酶的活性）=-7.127+7.435X（线粒体通透转换孔的OD值）。二、动物实验①最后纳入研究的动物35只。②在线粒体通透转换孔在0 min、30 min和60min的OD值比较中,各组线粒体通透转换孔的变化,均呈下降趋势。空白对照组在60min时的OD值与30min时比较,有统计学意义（P＜0.05）;模型组在60 min时的OD值与0min与30min时比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,而且30min时的OD值与0min时的比较,也有统计学意义（P＜0.05）;而雌激素组在各个时间点上的比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）;中药组在60min时的OD值;与0min与30min时比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,但30min时的OD值与0min,时的比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。③在线粒体通透转换孔活性比较方面,各组在线粒体通透转换孔活性比较方面,在30min/0minOD比值的比较中,空白对照组的OD值为1.000±0.025,模型组为0.975±0.014,雌激素组为0.993±0.022,中药组为0.990±0.010。雌激素组、空白对照组与模型组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）,而中药组与其他各组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。而在60min/0minOD比值的比较中,空白对照组的OD值为1.000±0.047,模型组为0.956±0.016,雌激素组为0.984±0.030,中药组为0.976±0.025,雌激素组和空白对照组与模型组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）,而中药组与其他各组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。各组在30min/0min与60min/0minOD比值比较中,除空白对照组的两个比值,差异无统计学意义外（P＞0.05）,其余各组的比值,差异均有统计学意义。④在细胞色素C氧化酶比较方面,空白对照组为0.0200±0.0141,模型组为0.0070±0.0051,雌激素组为0.0134±0.0064,中药组为0.0130±0.0092,空白对照组的活性与模型组的比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。雌激素组、中药组与模型组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;⑤在线粒体活性氧比较方面,空白对照组（1898.89±1078.39、1900.00±1078.76、1911.33±1078.14、1911.33±1077.37）、模型组（2271.22±1349.76、2282.79±1350.78、2297.22±1376.74、2297.00±1375.35）、雌激素组（2227.67±1365.95、2239.89±1363.75、2244.11±1363.55、2242.00±1357.36）和中药组（1536.25±835.51、1576.38±836.50、1550.86±835.27、1550.86±835.27）在15min、20min、30min、45min比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）,但在这些时间点上,模型组的含量最高,其次为雌激素组和空白对照组,最后为中药组。结论:骨骼肌线粒体变化和骨质疏松存在着互相影响的关系,而通过药物干预后,能有效地调控线粒体的活性变化,抑制肌细胞的凋亡,从而有效地调控骨质疏松的发展。主要结论如下:①在线粒体通透转换孔的通透性方面,骨质疏松骨骼肌的通透性增大,表示有更多的促凋亡的物质刺激或通过该孔,从而更快地诱导细胞的凋亡,也提示骨质疏松骨骼肌的线粒体损伤程度较非骨质疏松的严重。②在细胞色素C氧化酶方面,骨质疏松骨骼肌的细胞色素C氧化酶活性较非骨质疏松低,提示骨质疏松骨骼肌的线粒体外膜完整性较非骨质疏松的差,从而揭示骨质疏松骨骼肌的细胞凋亡速度较非骨质疏松快。③在线粒体通透转换孔的通透性与细胞色素C氧化酶的关系方面,线粒体通透转换孔的OD比值与细胞色素C氧化酶的活性存在着正相关的关系,而线粒体OD比值与通透性是反比的关系,这说明,线粒体通透转换孔的通透性越大（OD比值越小）,细胞色素C氧化酶的活性越小。这揭示了只要维持细胞色素C氧化酶的活性,就能有效地防治细胞的过早衰老。从另一个侧面来说,这就为治疗骨质疏松提供一个新的治疗靶点。④在活性氧的活性方面,骨质疏松和非骨质疏松没有明显的差异,可能的原因是活性氧含量的多少对雌激素缺乏大鼠骨骼肌的影响表现不敏感。但随着时间的推移,其含量是不断增加的,这表示细胞在不断积累,当到达一定量时启动细胞的凋亡程序。⑤补肾健脾中药在线粒体通透转换孔、细胞色素C氧化酶和或活性氧这三个指标中,尽管与雌激素相比,未能达到明显的效果,但从其数值的变化来说,认为该中药可以改善线粒体通透转换孔的通透性,提高细胞色素C氧化酶和降低活性氧的含量,是未来研究以骨骼肌为作用靶点的药物之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 国内外研究进展
• 第一节 骨质疏松与骨骼肌关系的认识及进展
• 一、骨质疏松的病因病机
• 二、骨质疏松和骨骼肌的关系认识及研究进展
• 第二节 骨骼肌与线粒体的关系认识
• 一、线粒体和中医脾的关系认识
• 二、骨骼肌与线粒体的关系探讨
• 第二部分 临床部分
• 第一节 研究对象
• 第二节 研究方法
• 1.标本的收集
• 2.主要的试剂及仪器
• 3.线粒体的提取
• 4.线粒体蛋白含量的测定
• 5.线粒体通透转换孔的检测
• 6.细胞色素C氧化酶的检测
• 7.统计学方法
• 第三节 研究结果
• 1.两组标本在线粒体通透转换孔方面的比较
• 2.两组标本在线粒体细胞色素C氧化酶的活性比较
• 3.线粒体通透转换孔与细胞色素C氧化酶的相关性分析
• 第三部分 实验部分
• 第一节 研究对象
• 第二节 研究方法
• 1.实验动物的分组、造模及治疗方法
• 2.标本的收集
• 3.主要的试剂及仪器
• 4.线粒体的提取
• 5.线粒体蛋白含量的测定
• 6.线粒体通透转换孔的检测
• 7.细胞色素C氧化酶的检测
• 8.线粒体活性氧的检测
• 9.统计学方法
• 第三节 研究结果
• 1.实验动物数量的分析
• 2.造模3个月后骨密度的变化
• 3.各组在线粒体通透转换孔方面的比较
• 4.各组线粒体细胞色素C氧化酶的活性比较
• 5.各组线粒体在活性氧方面的比较
• 第四部分 讨论
• 一、线粒体损伤对骨骼肌的影响
• 二、“脾主肌、肾主骨”在治疗骨质疏松中的应用
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 研究生在学期间发表论文情况
• 致谢