靶向聚乙烯亚胺介导的SHP基因抗肝纤维化作用的研究

论文摘要

肝纤维化是所有慢性肝病发生发展的共同病理基础和病理特征。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）在肝纤维化的发生发展中起到了关键作用。研究发现含RGD结构的环形多肽能与HSC表面的Ⅵ型胶原受体特异性结合。小异二聚体（SHP,一种核受体）,作为法呢醇X受体-小异二聚体（FXR-SHP）调控酶链上的关键环节,在细胞内高表达时可促进活化HSC转变为静止表型并促进其凋亡而发挥抗纤维化作用。聚乙烯亚胺（PEI）是近年来发展较快的阳离子聚合物非病毒载体,对它进行聚乙二醇修饰（PEG化）后可以提高溶解性,减小细胞毒性以及延长体内循环时间。本研究的主要目的是构建肝星状细胞（HSC）的特异性靶向阳离子聚合物载体RGD-PEG-PEI,携带SHP基因,通过体内外实验评价RGD-PEG-PEI/SHP的抗纤维化作用并探讨可能的作用机制。本研究的主要内容包括：RGD（Arg-Gly-Asp）环肽修饰PEG化聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究；RGD-PEG-PEI/SHP复合物对活化肝星状细胞的转染效果的研究；RGD-PEG-PEI/SHP复合物对大鼠肝纤维化的治疗效果的研究。第一部分RGD（Arg-Gly-Asp）环肽修饰PEG化聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究目的：研究RGD环肽修饰PEG化聚乙烯亚胺修饰作为基因治疗载体的制备过程及其理化性质,建立一个能携带质粒DNA的HSC特异性靶向基因治疗载体系统。方法：选用美国Nektar公司的产品NHS-PEG-MAL,它具有双功能基团,利用NHS和MAL基团不同反应活性的特点,使用简单的化学加成反应制备RGD-PEG-PEI复合物,利用质谱分析的方法鉴定产物并计算反应效率；SHP-pEGFP真核表达载体的构建并合成不同氮磷比（N/P）的RGD-PEG-PEI/SHP复合物,通过凝胶电泳阻滞分析复合物的包封率,粒度/zeta电位测定仪测定复合物的粒径和带电情况,MTT法测定其细胞毒性。结果：NHS-PEG-MAL的两个活性集团分别和RGD、PEI连接,质谱分析法证明反应成功和完全；1％RGD-PEG-PEI/SHP复合物的包封率在99%以上,粒径在157nm-160nm之间,随着复合物N/P的增加,粒径有减小的趋势而zeta电位有增加的趋势；1%RGD-PEG-PEI/SHP复合物细胞毒性在不同N/P比值上都显著低于PEI/DNA（P<0.01）。结论：成功地构建了具有RGD多肽靶向功能的PEG修饰的SHP基因聚乙烯亚胺治疗载体；对1%RGD-PEG-PEI/SHP复合物性质考察证明它包封率高,粒径和电位稳定且细胞毒性低。第二部分RGD-PEG-PEI/SHP复合物对活化肝星状细胞的转染效果评价目的：比较1％RGD-PEG-PEI/SHP、PEG-PEI/SHP、PEI/SHP和SHP不同复合物对活化的大鼠HSC的靶向作用和抗纤维化作用。方法：链霉蛋白酶E/Ⅳ型胶原酶灌注——梯度离心的方法从正常雄性SD大鼠（400-450g,14周龄）肝脏分离HSC,培养并传代：通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白报告基因表达评价体外细胞转染效率；荧光定量实时PCR（qRT-PCR）比较转染后HSC内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、α1（Ⅰ）型前胶原（α1（Ⅰ）procollagen）、组织金属蛋白酶抑制物—1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）、TIMP-2、基质金属蛋白酶—2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的mRNA表达的变化情况：Western Blot比较α-SMA和Ⅰ型胶原生成的变化情况。结果：流式细胞仪检测1%RGD-PEG-PEI/SHP组转染活化肝星状细胞后的荧光强度明显高于其它各治疗组（P<0.01）；1%RGD-PEG-PEI/SHP转染活化大鼠肝星状细胞后SHP mRNA水平和各组比明显升高（P<0.01）,同时细胞内α-SMA、TIMP-1、TIMP-2、TGF-β1和α1（Ⅰ）procollagen mRNA水平都有下降（P<0.01）,MMP-2 mRNA水平没有变化（P<>0.05）；1％RGD-PEG-PEI/SHP组的SHP表达显著提高（P<0.01）,α-SMA和Ⅰ型胶原的表达和各组比均显著降低（P<0.01）。结论：1％RGD-PEG-PEI/SHP组对活化HSC的转染效率显著提高；SHP mRNA表达明显升高,致肝纤维化的α-SMA、TGF-β1、α1（Ⅰ）procollagen、TIMP-1、TIMP-2基因的mRNA表达下降,MMP-2的mRNA表达没有变化；α-SMA和Ⅰ型胶原的生成明显减少。第三部分RGD-PEG-PEI/SHP复合物对大鼠肝纤维化的治疗效果目的：评价1%RGD-PEG-PEI/SHP对大鼠肝纤维化的治疗作用及其作用机制研究。方法：腹腔注射硫代乙酰胺（TAA）10周诱导大鼠出现肝纤维化。肝纤维化大鼠分成五组（n=8）：1%RGD-PEG-PEI/SHP、PEG-PEI/SHP、PEI/SHP:SHP和生理盐水对照。每组第3和第6周各注射一次相应的复合物一次。比较每组的肝脏病理分期、α-SMA阳性细胞凋亡率和抗纤维化各基因mRNA的表达情况。结果：与其他组相比,注射1%RGD-PEG-PEI/SHP后大鼠肝纤维化明显缓解,纤维化分期和炎症分级评分与各组比明显降低（P<0.01）；1%RGD-PEG-PEI/SHP诱导的α-SMA阳性细胞凋亡率显著升高（P<0.01）；1%RGD-PEG-PEI/SHP组治疗后大鼠肝组织中α-SMA、TIMP-1、TIMP-2、TGF-β1和α1 （Ⅰ） procollagenmRNA的表达和各组比下降明显（P<0.01）；MMP-2 mRNA的表达没有明显变化（P>0.05）。结论：1%RGD-PEG-PEI/SHP在大鼠纤维化模型中通过诱导α-SMA阳性细胞凋亡、下调肝纤维化基因表达等促进肝纤维化逆转,发挥靶向抗肝纤维化作用。

论文目录

• 英文缩略语
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 RGD（Arg-Gly-Asp）环肽修饰PEG化聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究
• 一. RGD—PEG—聚乙烯亚胺的合成和表征
• 材料与仪器
• 方法
• 结果
• 二. RGD-PEG-PEI/DNA复合物的制备及性质考察
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 RGD-PEG-PEI/SHP复合物对活化肝星状细胞的转染效果评价
• 材料与仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 RGD-PEG-PEI/SHP复合物对大鼠肝纤维化的治疗效果
• 材料与仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 总结
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢