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黄瓜花药培养及橙色果肉QTL分析和类胡萝卜素合成酶基因定位研究

2020-12-07阅读(1008)

黄瓜花药培养及橙色果肉QTL分析和类胡萝卜素合成酶基因定位研究

论文摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）是世界十大重要蔬菜作物,在世界各地广泛栽植。由于遗传背景狭窄,传统育种效率低,单倍体育种和分子辅助育种（Marker-assisted selection,MAS）越来越受到重视。1黄瓜花药培养研究花药培养是获得单倍体（Haploid）和双单倍体（Double haploid,DH）的有效途径,但有关黄瓜花药培养的研究报道目前世界仅见三篇,最近报道的花药培养诱导频率为1.6胚／花药和52单倍体/60花药,花培效率仍需提高。本研究针对花药培养过程中4℃低温预处理、33℃热激预培养、各培养阶段培养基成分和基因型等关键因素,设计6个独立试验,进行研究,结果如下：1)建立黄瓜花药培养体系确立黄瓜花药培养各阶段培养基成分：胚性愈伤诱导培养基：MS+1.0 mg/l6-BA+0.5 mg/l2,4-D+1.0 mg/lKT+3%蔗糖+0.8%琼脂；胚诱导培养基：MS+0.1 mg/lNAA+3.0 mg/l6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂；胚萌发培养基：MS+0.5 mg/l 6-BA+6%蔗糖+1.2%琼脂。明确影响黄瓜花药培养的两个关键因素：一是预处理和预培养温度的选择有赖于试材的生态型；二是胚诱导培养基中6-BA/NAA配合使用能够成功诱导胚性愈伤分化成胚。2)获得黄瓜花药培养再生DH植株基于本试验建立的花药培养体系,对31个不同基因型供试黄瓜进行花药培养,16个材料产生胚性愈伤组织,其中3个基因型（宁佳1号、5117和4560）获得再生植株。通过细胞学染色体计数、形态学统计分析和分子标记AFLP技术,确定120个宁佳1号再生植株中42个为双单倍体,花药培养比率为3胚／花药和42DH/45花药。2黄瓜橙色果肉QTL分析和类胡萝卜素合成酶基因定位研究类胡萝卜素在人类膳食营养中扮演着极为重要的角色。西双版纳黄瓜（C.sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan,2n=2x=14）成熟果果肉橙色,是培育富含类胡萝卜素黄瓜品种的优异种质。本研究针对黄瓜果肉颜色和主要类胡萝卜素含量进行数量性状位点（Quantitative trait loci,QTL）分析,为分子辅助育种（MAS）提供可靠的QTL标记；同时对黄瓜类胡萝卜素合成酶基因进行定位,为在分子水平上明确黄瓜类胡萝卜素合成途径提供目的基因。主要研究内容结果如下：1)遗传图谱的构建以白色果肉黄瓜与橙色果肉黄瓜构建两个F2作图群体（EC1×SWCC9和Gy7×USDA#14）,群体大小分别为79和143个单株。利用RAPD、SCAR、SSR、EST、SNP、AFLP和SSAP分子标记绘制遗传图谱。最终获得图谱1包含74个多态性位点,全长899.0cM,16个连锁群,平均间距12.0cM；图谱2包含23个位点,分作7个连锁群,全长230.9cM,平均间距9.6cM。通过比较两张图谱的分子标记信息,发现图谱1的连锁群（Linkage group,LG） 6和图谱2的LG3上存在一个共线性区域,包括3个显性标记（RAPDAG131200、RAPDP11750和SNPN8SNPG2H3569）和1个共显性标记（SNPAB14SNPG1H1470/519）。2)果肉颜色QTL的分析基于两个F2群体进行黄瓜果肉颜色QTL分析,在群体1上检测到4个控制中果皮颜色（Mesocarp color, MC）的QTL（mc6.1、mc6.2、mc9.1和mc15.1）,和5个控制内果皮颜色（Endocarp color, EC）的QTL（ec6.1、ec6.2、ec6.3、ec9.1和ec16.1）。在群体2上检测到2个控制中果皮颜色的QTL（mc2.1、mc3.1）和3个控制内果皮颜色的QTL（ec2.1、ec3.1、ec5.1）.其中位于图谱1的2个果肉颜色QTL （mc6.1和ec6.1）与图谱2的2个果肉颜色QTL（mc3.1和ec3.1）位于两个图谱的共线性区域,说明它们是在西双版纳黄瓜遗传背景下稳定出现的控制果肉颜色的QTL。3)果肉类胡萝卜素含量的QTL分析对群体2单株的白色果肉和橙色果肉进行高效液相色谱（High-performance liquid chromatography,HPLC）分析,明确β-胡萝卜素和叶黄素是橙色果肉的主要类胡萝卜素成分。利用群体2,对这两种橙色果肉中主要类胡萝卜素含量进行QTL分析,结果在图谱2上检测到1个控制中果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点（mdb2.1）,2个控制内果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点（edb2.1和edb3.1）,2个控制中果皮叶黄素含量的QTL位点（mdx3.1和mdx3.2）,和1个控制内果皮叶黄素含量的QTL位点（edx3.1）。其中控制内果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点（edb3.1）和控制中果皮叶黄素含量的QTL位点（mdx3.1）与果肉颜色QTL（mc3.1和ec3.1）位于相同的区间内。4)黄瓜类胡萝卜素合成酶基因定位通过同源引物设计,最终将黄瓜类胡萝卜素合成酶基因9-顺式类胡萝卜素双加氧酶基因（9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）以单核苷酸多态性（Single nucleotide Polymorphism,SNP）标记形式,定位于两张图谱共线性区域的不同位置。NCED的引入,没有改变图谱原有序列。5)其他农艺性状的QTL定位针对群体1的子叶长（Cotyledon length,CL）.下胚轴长（Hypocotyl length, HL）、第一分枝节数（Node of first branch, NFB）、主茎直径（Diameter of main stem, DM）、叶长（Leaf length, LL）和叶宽（Leaf width, LW）等农艺性状,和群体2的果实长（Fruit length, FL,）、果实纵径（Fruit width, FW）和果肉糖含量（Sugar content,S）等性状进行QTL分析,结果发现糖含量（s3.1）与果肉颜色（mc3.1和ec3.1）和类胡萝卜素含量（edb3.1和mdx3.1）位于相同的区间内。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语表
  • 引言
  • 参考文献
  • 上篇 文献综述
  • 第一章 花药培养研究进展
  • 1 作物花药培养研究动态
  • 1.1 花药培养诱导花粉胚状体形成、增殖和分化的形态发生过程
  • 1.2 影响花药培养关键因素的筛选和优化
  • 1.2.1 基因型
  • 1.2.2 预处理
  • 1.2.3 培养基成分
  • 1.2.3.1 基础培养基
  • 1.2.3.2 激素
  • 1.2.3.3 糖源
  • 2 黄瓜花药培养研究动态
  • 3 小结
  • 参考文献
  • 第二章 作物类胡萝卜素QTL定位及合成酶基因的研究进展
  • 1 类胡萝卜素概述
  • 2 作物类胡萝卜素QTL定位研究进展
  • 3 作物类胡萝卜素关键合成酶基因的研究进展
  • 4 黄瓜类胡萝卜素QTL定位与合成酶基因的研究现状
  • 5 小结
  • 参考文献
  • 下篇 研究报告
  • 第三章 黄瓜花药培养的研究
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 花药培养流程
  • 1.2.1 取材和预处理
  • 1.2.2 外植体灭菌过程和接种过程
  • 1.2.3 再生植株的扩繁生根驯化和移栽
  • 0（花培再生植株）的细胞学研究和AFLP分析与R0（花培再生植株）及其自交1代R1的形态学分析'>1.2.4 花培再生植株的倍性和同质性检验:R0（花培再生植株）的细胞学研究和AFLP分析与R0（花培再生植株）及其自交1代R1的形态学分析
  • 0）的细胞学研究'>1.2.4.1 花培再生植株（R0）的细胞学研究
  • 0）的AFLP分析'>1.2.4.2 花培再生植株（R0）的AFLP分析
  • 0）及其自交1代（R1）的形态学分析'>1.2.4.3 花培再生植株（R0）及其自交1代（R1）的形态学分析
  • 2 试验设计
  • 2.1 试验1:4℃低温预处理不同天数对花药胚性愈伤诱导率的影响
  • 2.2 试验2:胚性愈伤诱导培养基对胚性愈伤诱导的影响
  • 2.3 试验3:不同预培养条件对花药胚性愈伤诱导率的影响
  • 2.4 试验4:胚诱导培养基
  • 2.5 试验5:胚状体萌发培养基
  • 2.6 试验6:基因型对黄瓜花药培养的影响
  • 2.7 数据统计
  • 3 结果
  • 3.1 黄瓜花药培养胚胎发生的过程
  • 3.2 4℃C冷预处理对花药培养胚性愈伤组织诱导率的影响
  • 3.3 33℃热激1H和光暗预培养对花药培养胚性愈伤组织诱导率的影响
  • 3.4 胚性愈伤诱导培养基对胚性愈伤组织诱导的影响
  • 3.5 胚诱导培养基对诱导胚性愈伤产生胚的影响
  • 3.6 胚萌发培养基对胚萌发的影响
  • 3.7 基因型对花药培养的影响
  • 0（花培再生植株）的细胞学研究结果'>3.8 宁佳1号R0（花培再生植株）的细胞学研究结果
  • 0（花培再生植株）的AFLP分析结果'>3.9 宁佳1号R0（花培再生植株）的AFLP分析结果
  • 0（花培再生植株）及其自交1代R1的形态学分析结果'>3.10 宁佳1号R0（花培再生植株）及其自交1代R1的形态学分析结果
  • 4 讨论
  • 4.1 4℃低温预处理和33℃高温热激预培养对黄瓜花药培养胚性愈伤诱导率的影响
  • 4.2 2,4-D对花药培养胚性愈伤组织诱导的影响
  • 4.3 NAA与6-BA配合使用对花药培养胚诱导的影响
  • 4.4 干燥对花培胚状体萌发的影响
  • 4.5 基因型对花药培养的影响
  • 4.6 花培再生植株的同质性检测
  • 5 小结
  • 参考文献
  • 第四章 黄瓜橙色果肉QTL分析与类胡萝卜素合成酶基因定位的研究
  • 摘要
  • 第一节 源于西双版纳黄瓜的分子遗传图谱构建
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 试验设计
  • 1.3 DNA提取
  • 1.4 分子标记分析
  • 1.4.1 RAPD、SCAR、SSR、EST和SNP分子标记分析
  • 1.4.2 AFLP和SSAP分子标记分析
  • 1.4.2.1 酶切（DIGESTION）
  • 1.4.2.2 连接（LIGATION）
  • 1.4.2.3 预扩增（PRE-AMPLIFICATION）
  • 1.4.2.4 选择性扩增（SELECTIVE AMPLIFICATION）
  • 1.4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色分析AFLP和SSAP的PCR产物
  • 2群体基因型分离数据的收集'>1.5 双亲多态性筛选及F2群体基因型分离数据的收集
  • 1.6 分子遗传图谱的构建
  • 2 结果
  • 2.1 分子标记在亲本和F2群体中的分离分析
  • 1的扩增和多态性筛选'>2.1.1 RAPD引物在两组双亲及其F1的扩增和多态性筛选
  • 2.1.1.1 RAPD引物在EC1、SWCC9和EC1×SWCC9的扩增和多态性筛选
  • 2.1.1.2 RAPD引物在GY7、USDA#14和GY7×USDA#14中的扩增和多态性筛选
  • 2群体的分离'>2.1.2 RAPD引物在两个F2群体的分离
  • 2群体1（EC1×SWCC9）的分离'>2.1.2.1 RAPD引物在F2群体1（EC1×SWCC9）的分离
  • 2群体2（GY7×USDA#14）的分离'>2.1.2.2 RAPD引物在F2群体2（GY7×USDA#14）的分离
  • 2群体中的分离'>2.1.3 SCAR引物的扩增、多态性筛选及其在F2群体中的分离
  • 2群体中的分离'>2.1.4 SSR引物的扩增、多态性筛选及其在F2群体中的分离
  • 2群体中的分离'>2.1.5 EST引物的扩增、多态性筛选及其在F2群体中的分离
  • 2群体中的分离'>2.1.6 SNP引物的扩增、多态性筛选及其在F2群体中的分离
  • 2.1.7 ECOR Ⅰ/MSE Ⅰ AFLP和ECOR Ⅰ/LOS Ⅰ SSAP引物在群体1的扩增、多态性筛选,和在群体中的分离
  • 2.2 分子遗传图谱的构建
  • 2.2.1 源于群体1（EC1×SWCC9）的分子遗传图谱（MAP1）的构建
  • 2.2.2 源于群体2（GY7×USDA#14）的分子遗传图谱（MAP2）的构建
  • 2.3 图谱比较
  • 2.3.1 两张图谱共有分子标记的分析
  • 2.3.2 共线性区域
  • 3 讨论
  • 3.1 两组作图双亲（EC1和SWCC9及GY7和USDA#14）的多态性比较
  • 3.2 源于EC1×SWCC9和GY7×USDA#14作图群体的两张遗传图谱的饱和度
  • 4 小结
  • ABSTRACT
  • 第二节 黄瓜橙色果肉和主要类胡萝卜素含量QTL分析
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 试验设计
  • 1.3 表型数据的采集
  • 1.3.1 黄瓜果肉颜色表型数据的采集
  • 1.3.2 黄瓜果肉类胡萝卜素含量表型数据的采集
  • 1.4 表型数据的QTL分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 黄瓜果肉颜色在两张遗传图谱上的QTL定位
  • 2.1.1 黄瓜果肉颜色在图谱1的QTL定位
  • 2.1.2 黄瓜果肉颜色在图谱2的QTL定位
  • 2.2 两组黄瓜果肉颜色QTL定位结果的比较
  • 2.3 黄瓜果肉类胡萝卜素含量的HPLC检测分析结果
  • 2.4 黄瓜果肉类胡萝卜素含量在遗传图谱2上的QTL定位
  • 3 小结
  • ABSTRACT
  • 第三节 黄瓜类胡萝卜素合成酶基因的图谱定位
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 黄瓜类胡萝卜素合成酶基因特异引物的设计
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • ABSTRACT
  • 2群体其他农艺性状的QTL定位'>第四节 源于西双版纳黄瓜F2群体其他农艺性状的QTL定位
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 试验设计
  • 1.3 表型数据的采集
  • 1.3.1 形态学性状调查
  • 1.3.2 黄瓜果肉糖含量的表型数据采集
  • 2 结果与讨论
  • ABSTRACT
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 创新之处
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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