四种鸡球虫DNA疫苗在机体组织中的分布和在环境中的释放

论文摘要

为了对本实验室构建的四种鸡球虫DNA疫苗：pVAX1.0-TA4-IL-2, pVAX1.0-NA4-IL-2, pVAX1.0-EM8-IL-2, pVAX1.0-LDH-IL-2进行安全性评价,开展了该疫苗的生物安全性试验。按照对最小使用日龄靶动物1次单剂量接种的安全试验要求,将试验动物分为疫苗免疫组和非免疫空白对照组,每羽25μg,于1日龄进行腿部肌肉注射免疫1次；按照对靶动物单剂量重复接种的安全试验要求,将试验动物分为疫苗免疫组和非免疫空白对照组共2组,每羽25μg,分别于7日龄、14日龄、21日龄3次进行腿部肌肉注射免疫；按照3批制品对靶动物1次超剂量接种的安全试验要求,将试验动物分为第一批疫苗组、第二批疫苗组、第三批疫苗组和空白对照组共4组,每羽75μg于14日龄进行腿部肌肉注射免疫1次；免疫之后每天观察实验动物的精神状态、饮水、进食、粪便、活动及死亡情况等,并进行详细的记录。于免疫后的1-4个月内分别定期采集鸡血液以及心、肝、脾、肾、肠、注射部位肌肉等组织,根据质粒DNA疫苗中基因序列分别设计并合成引物,以PCR方法检测Kana基因；TA4基因；NA4基因；EM8基因和LDH基因,用来判断质粒或其部分基因片段在上述脏器组织的分布和存留时间,以及是否整合入动物组织细胞染色体；制备心、肝、脾、肾、肠、注射部位肌肉等组织石蜡切片,观察质粒DNA能否导致机体产生病理损伤。按照对靶动物的环境释放安全性试验要求,将上述靶实验动物于免疫前、免疫后1周后每隔2周多点采集受试点周围水体和实验动物的粪便样品,以PCR方法检测Kana基因；TA4基因；NA4基因；EM8基因和LDH基因,从而判断质粒是否发生转移以及质粒DNA是否经机体主谢产物被排放到外界环境中。按照对其他非靶动物的安全性试验要求,采用试验动物为3周龄ICR小鼠,每只25μg,于30日龄进行腿部肌肉注射免疫一次。于免疫后的1—3个月内分别定期采集小鼠血液以及心、肝、脾、肾、注射部位肌肉组织,按照上述PCR方法判断质粒在非靶动物脏器组织内的分布和存留时间,以及是否整合入其细胞染色体；制备石蜡切片观察质粒DNA能否能引起非靶动物的病理损伤。结果显示,受试动物未出现任何异常临床生理反应；DNA疫苗携带的五种基因均未转化入肠道菌群；质粒DNA也没有被排放到外界环境中；在血液、心、肝、脾、肾和注射部位均能检测到质粒DNA或其主要元件,并分别能存留约于免疫后的2个月左右,免疫后3个月之后就不能检测出质粒DNA或其主要元件；质粒DNA未与染色体DNA发生整合；上述主要脏器及组织均未出现病理学变化.上述安全性评价说明,四种球虫DNA疫苗对靶动物和非靶动物以及周围环境都具有较高的安全性,符合农业部《农业转基因生物安全管理条例》的要求.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 鸡球虫病免疫学研究进展
• 1 鸡艾美耳球虫致病特点
• 1.1 鸡球虫的生活史
• 1.2 鸡球虫病的流行病学
• 1.3 鸡球虫的致病性
• 1.4 鸡球虫病的危害及影响
• 2 鸡艾美耳球虫的入侵机理
• 2.1 鸡球虫入侵的特异性
• 2.2 鸡球虫的入侵机理
• 3 鸡球虫的免疫原性
• 4 宿主的免疫应答作用
• 4.1 非特异性免疫
• 4.2 特异性免疫
• 5 展望
• 参考文献
• 第二章 DNA疫苗的研究进展
• 1 DNA疫苗的发现
• 2 DNA疫苗的优点
• 3 DNA疫苗的构成
• 4 DNA疫苗的免疫机制
• 4.1 诱导MHCⅠ的CTL反应
• 4.2 诱导辅助性T细胞（Th）的免疫反应
• 4.3 刺激长期的免疫记忆
• 4.4 质粒DNA骨架的佐剂效应
• 5 DNA疫苗的免疫途径
• 5.1 肌肉注射法
• 5.3 粘膜免疫法
• 5.4 体内电穿孔法
• 5.5 基因枪导入法
• 5.6 其它DAN免疫途径
• 6 DNA疫苗的安全性
• 6.1 DNA疫苗能否整合至宿主细胞基因组
• 6.2 DNA疫苗能否产生DNA抗体和自身免疫反应
• 6.3 DNA疫苗能否产生免疫耐受
• 7 DNA疫苗在球虫方面的应用
• 8 展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 四种鸡球虫DNA疫苗在靶动物体内组织中的分布
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第四章 四种球虫DNA疫苗在非靶动物组织中的分布
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第五章 四种鸡球虫DNA疫苗在环境中的释放
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 致谢