论文摘要
目的探讨人脂联素球状结构域（globular domain of adiponectin,gAd）促进3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖后,葡萄糖可能的代谢去路。方法培养并分化3T3-L1脂肪细胞,分化成熟后用油红O染色法进行脂质鉴定；透析复性gAd,完成透析后以考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以含有不同浓度gAd （10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL）的干预液干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞5h；收集干预液残液以葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度,并以实时荧光定量（real time PCR,RT-PCR）法测定细胞内糖酵解途径关键酶己糖激酶（hexokinase,HK）、6-磷酸果糖激酶-1（6-phosphofructokinase-1,PFK-1）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）在转录水平表达的变化,同时测定脂肪酸合成代谢关键酶乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）、脂肪酸分解代谢关键酶肉碱脂酰转移酶I （carnitine palmitoyltransferase I, CPT-Ⅰ）、甘油三酯合成代谢关键酶甘油-3-磷酸酰基转移酶（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT）、磷酸戊糖途径关键酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase,G6PD）在转录水平表达的变化；以蛋白免疫印迹法（Western blot）测定PK和CPT-Ⅰ在翻译水平表达的变化。用SPSS 17.0统计分析软件建立数据库分析数据,数据以均数±标准差（M±S.D）表示,检验水准α=0.05。结果1.gAd对3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖能力的影响各组细胞干预液残液中葡萄糖浓度差异显著（F=98.065,P=0.000）。其中,各实验组（gAd浓度依次为10、50、100、300、1000ng/mL）残液中葡萄糖浓度均显著低于对照组（P均<0.01）,且100ng/mL gAd组较50ng/mL gAd组也降低（P<0.01）。进一步对残液中葡萄糖浓度降低程度与gAd浓度进行相关性分析显示,在相同作用时间内,随着gAd浓度的增加葡萄糖浓度降低程度逐渐增加（r=0.699,F=10.721,P=0.005）2.gAd对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖酵解关键酶（HK、PFK-1、PK）表达的影响各组细胞HK转录水平的表达差异显著（F=125.789,P=0.000）。其中,各实验组（gAd浓度分别为10、50、100、300、1000ng/mL）表达与对照组相比均显著增加（P均<0.01）,且高剂量实验组对HK表达的上调作用均显著高于前一低剂量实验组（P均<0.05）。各组细胞PFK-1在转录水平的表达差异显著（F=85.399,P=0.000）。其中10ng/mL gAd组表达与对照组相比无差别（P=0.295）,其余各实验组（gAd浓度分别为50、100、300、1000ng/mL）表达与对照组比较均显著增加（P均<0.01）,且50ng/mL、100ng/mL、300ng/mLgAd组对其表达的上调作用均显著高于前一低剂量实验组（P均<0.05）。各组细胞PK在转录水平的表达差异显著（F=113.661,P=0.000）。其中,10ng/mL gAd组表达与对照组比较无差别（P=0.073）,其余各实验组（gAd浓度分别为50、100、300、1000ng/mL）表达与对照组比较显著增加（P均<0.01）,且高剂量实验组对PK表达的上调作用均显著高于前一低剂量实验组（P均<0.05）。由此可知,gAd对于HK、PFK-1、PK在转录水平的表达均有上调作用。.同时Western blot结果显示,各组细胞PK在翻译水平的表达同样差异显著（F=161.007,P=0.00）,其中,50、100、300、1000ng/mL gAd组的表达显著高于对照组（P均<0.01）。3.gAd对3T3-L1脂肪细胞中脂肪代谢相关关键酶（GPAT、ACC、CPT-I）表达的影响各组细胞GPAT在转录水平的表达（对照组、10ng/mL gAd组、50ng/mL gAd组、100ng/mL gAd组、300ng/mL gAd组、1000ng/mL gAd组）无差别（F=1.400,P=0.292）；各组细胞ACC在转录水平的表达差异显著（F=32.546,P=0.000）,其中,各实验组（gAd浓度分别为10、50、100、300、1000ng/mL）表达与对照组相比均显著增加（P均<0.05）,且50ng/mL gAd实验组对其表达的上调作用显著高于10ng/mL gAd实验组（P<0.05）；各组细胞CPT-Ⅰ在转录水平的表达差异显著（F=381.854,P=0.000）,其中各实验组（gAd浓度分别为10、50、100、300、1000ng/mL）表达均显著高于对照组（P均<0.01）,且高剂量实验组对其表达的上调作用均显著高于前一低剂量实验组（P均<0.01）。该结果说明,gAd对3T3-L1脂肪细胞内GPAT在转录水平的表达无影响,对ACC和CPT-Ⅰ在转录水平的表达具有上调作用。同时,Western blot结果显示,各组细胞CPT-Ⅰ在翻译水平的表达同样差异显著（F=268.099,P=0.000）,其中各实验组（gAd浓度分别为10、50、100、300、1000ng/mL）表达与对照组相比显著增加（P均<0.01）4.gAd对3T3-L1脂肪细胞磷酸戊糖途径关键酶（G6PD）表达的影响各组细胞G6PD在转录水平的表达（对照组、10ng/mL gAd组、50ng/mL gAd组、100ng/mL gAd组、300ng/mL gAd组、1000ng/mL gAd组）无差别（F=1.545,P=0.248）。结论1.本课题组制备的原核基因重组gAd可以促进3T3-L1脂肪细胞摄取胞外葡萄糖,说明本课题组制备的原核基因重组gAd具有野生活性。2.gAd促进3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的同时,激活了细胞内葡萄糖分解供能途径和脂肪酸合成与分解途径,提示摄取到3T3-L1脂肪细胞内的葡萄糖进行了分解供能和合成脂肪酸代谢。3.本研究为gAd生物制剂的开发和gAd生物学活性的研究奠定了基础。
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标签：脂联素球状结构域论文; 脂肪细胞论文; 葡萄糖代谢论文; 关键酶论文;