论文题目: 三乙烯四胺与G-四链体DNA相互作用、抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 应用化学
作者: 殷菲
导师: 彭孝军
关键词: 三乙烯四胺,四链体,端粒酶抑制剂,端粒酶
文献来源: 大连理工大学
发表年度: 2005
论文摘要: 端粒酶表达于85%以上的肿瘤细胞中,能够维持细胞中端粒的长度,对永生化细胞的增殖具有重要作用,而在大多数人正常体细胞中却没有表达。因此,端粒酶己成为抗肿瘤治疗的重要靶点,端粒酶抑制剂则有望成为高效、低毒的新型抗肿瘤药物。 抑制端粒酶活性有多种途径,其中以提高G-四链体DNA（简称G4-DNA）结构的稳定性为目标的端粒酶抑制剂的筛选是目前研究的热点。端粒DNA序列在K+、Na+等离子的存在下能够形成稳定的G4-DNA结构,这种结构阻碍了端粒酶对端粒DNA引物的识别,从而抑制了端粒酶的表达。研究人员发现,某些具有特定结构和性质的化合物能够通过稳定G4-DNA结构抑制端粒酶活性,进而抑制肿瘤细胞的增殖。 本课题在对G4-DNA及现有以G4-DNA为靶点的小分子化合物的结构进行分析的基础上,大胆推测三乙烯四胺（Triethylene tetramine,TETA）能够与G4-DNA产生相互作用提高其稳定性。因此,本文以三乙烯四胺为研究对象,探讨了该化合物对G4-DNA稳定性、端粒酶活性及细胞增殖的影响,旨在开发一种以G-四链体DNA为靶点的新型小分子端粒酶抑制剂。 圆二色谱（Circular Dischroism,CD）是测定多核苷酸结构变化最灵敏的方法之一,也是研究寡核苷酸多态结构的一种重要手段。寡核苷酸形成G4-DNA结构以后,其CD谱图具有明显的特征。对TETA与寡核苷酸d（TGGGGT）和d（TTAGGG）4作用后CD谱图的峰形及强度变化的分析表明,TETA能够促进分子间平行G4-DNA的形成,并促使分子内自身折叠型G4-DNA由“平行型”构型向“反平行型”构型转变。 对TETA与寡核苷酸作用后的DNA热变性曲线的分析发现,当TETA的浓度为100μM时,与K+存在条件下相比,寡核苷酸d（TTAGGG）4和d（TGGGGT）形成的G4-DNA的解链温度分别升高了10℃和26℃,表明TETA能显著增强G4-DNA的稳定性。 随后,我们用改进的TRAP（Telomeric repeat amplification protocol）-银染法考察了TETA对端粒酶活性的影响。实验结果表明,TETA不仅能在体外抑制端粒酶活性(抑制50%端粒酶活性的有效浓度,即IC50tel值为7.8μM):并且能够抑制HeLa细胞内的端粒酶活性。为了区别TETA对端粒酶即Taq聚三乙烯四胺与G一四链体DNA相互作用、抑制端粒酶活性及抗肿痛活性研究合酶的抑制作用,我们进行了Taq聚合酶活性检测,当TETA的浓度达到100林M时,仍然对Taq聚合酶活性没有显著影响。 肿瘤细胞的主要特点是恶性增殖,抑制肿瘤细胞的增殖是筛选抗肿瘤药物的重要指标。本文研究结果证实,TETA能够抑制端粒酶阳性的HeLa、MCF一7、K562、ECV·304及PC12细胞的增殖。作用72小时,TETA对各种细胞的半数抑制浓度（IC5o值）分别为:HeLa细胞75林M,MCF·7细胞124林M,K562细胞175林M,EeV一304细胞221林M,PelZ细胞452林M;而对端粒酶阴性的人正常细胞HLF细胞的增殖则基本没有影响。流式细胞仪检测结果说明,TETA抑制HeLa细胞增殖与其调节细胞周期,引起GO/G,期阻滞的作用相关。 上述研究结果表明,TETA能稳定G4一DNA结构并抑制端粒酶活性,进而抑制肿瘤细胞增殖,是一种具有开发潜力的小分子端粒酶抑制剂。关键词:三乙烯四胺:G一四链体DNA:端粒酶抑制剂;端粒酶、
论文目录:
摘要
Abstract
引言
参考文献
1 文献综述
1．1 端粒及端粒酶
1．1．1 端粒
1．1．2 端粒酶
1．1．3 端粒酶活性的检测方法
1．2 端粒、端粒酶与肿瘤
1．2．1 端粒与衰老
1．2．2 端粒酶与肿瘤的关系
1．3 端粒酶抑制剂的研究进展
1．3．1 与端粒酶相关的抑制剂
1．3．2 与端粒相关的抑制剂
1．3．3 其它抑制剂
1．4 G-四链体DNA—抗肿瘤药物设计的新靶点
1．4．1 G-四链体DNA的结构
1．4．2 以G-四链体DNA为靶点的端粒酶抑制剂研究进展
1．5 以端粒酶为靶点开发抗肿瘤药物值得注的问题
参考文献
2 选题依据及论文构思
2．1 选题依据
2．2 论文构思
参考文献
3 三乙烯四胺对G-四链体DNA稳定性的影响
3．1 实验材料及设备
3．1．1 实验材料
3．1．2 仪器设备
3．2 实验方法
3．2．1 寡核苷酸的合成及纯化
3．2．2 G4-DNA的形成
3．2．3 圆二色谱(Circular Dischroism,CD)的测定
3．2．4 热变性曲线的测定
3．2．5 热力学数据计算
3．3 实验结果
3．3．1 寡核苷酸的圆二色谱研究
3．3．2 G4-DNA解链温度(melting point,T_m)的测定
3．3．3 寡核苷酸d(TTAGGG)_4样品的热力学计算
3．4 讨论
3．4．1 TETA对G4-DNA结构及稳定性的影响
3．4．2 TETA与G4-DNA的作用方式
3．4．3 与G4-DNA相互作用化合物在抗肿瘤药物研究中的意义
3．5 小结
参考文献
4 三乙烯四胺对端粒酶活性的影响
4．1 实验材料及设备
4．1．1 实验材料
4．1．2 仪器设备
4．2 实验方法
4．2．1 HeLa细胞培养
4．2．2 细胞的裂解及蛋白提取液的制备
4．2．3 端粒酶活性测定
4．2．4 TETA对HeLa细胞中端粒酶活性的影响
4．2．5 Taq聚合酶活性检测
4．3 实验结果
4．3．1 TETA对端粒酶活性的抑制
4．3．2 TETA对HeLa细胞中端粒酶活性的影响
4．3．3 Taq聚合酶活性检测
4．4 讨论
4．5 小结
参考文献
5 三乙烯四胺对细胞增殖的影响
5．1 实验材料及设备
5．1．1 实验材料
5．1．2 仪器设备
5．2 实验方法
5．2．1 细胞培养
5．2．2 细胞活力(Cell Viability)检测
5．2．3 流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化及细胞凋亡
5．2．4 数据分析
5．3 实验结果
5．3．1 TETA对细胞活力的影响
5．3．2 流式细胞仪测定TETA对HeLa细胞周期的影响
5．4 讨论
5．4．1 TETA对肿瘤细胞的选择性
5．4．2 TETA对肿瘤细胞增殖的影响
5．4．3 问题与展望
5．5 小结
参考文献
结论
攻读博士学位期间发表学术论文情况
创新点摘要
致谢
大连理工大学学位论文版权使用授权书
发布时间: 2005-07-04
参考文献
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