改良钛支架人工角膜的实验研究

改良钛支架人工角膜的实验研究

论文摘要

目的:研究与评估改良钛支架人工角膜的生物相容性和角膜生物愈合的过程;探讨制作这种新型人工角膜的方法。体内实验观察改良后其生物相容性是否增加,观察临床表现和并发症,并取材检测MMP-2、TIMP-2在兔角膜组织的表达,探讨角膜溶解并发症的机理,为临床治疗提供依据。方法:1.设计及制备改良钛支架人工角膜;采用喷砂(SB)工艺预处理人工角膜钛支架,使其表面变粗糙,然后用酸碱两步法在人工角膜钛支架表面快速沉积羟基磷灰石(HA)涂层,改良的人工角膜钛支架(HA/SB-Ti)外型由二襻改为三襻。采用美国Lambda Research Corporation开发的光学设计软件OSLO,按照几何光学原理设计人工角膜的镜柱,用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate PMMA)为原料按设计好的图纸手工磨制。XRD和SEM分析涂层成分、表面形貌。2.将18只正常新西兰白兔及18只新西兰白兔角膜碱烧伤模型随机分为3组,其中1组、2组右眼角膜基质层内分别植入人工角膜支架HA/SB-Ti、SB-Ti,第3组仅做角膜板层切口而不植入支架为手术对照组,另取两只正常白兔作空白对照。术后裂隙灯观察角膜水肿及新生血管产生情况,同时观察支架的存留时间和并发症。术后1个月、3个月取材,石蜡包埋后,行HE染色光镜下观察支架与组织界面愈合情况;2.5%戊二醛内固定后,透射电镜观察支架植入后对角膜组织的影响;支架取出后,SEM观察材料表面组织贴附情况及HA涂层存留情况。3.二期植入改良钛支架人工角膜镜柱,观察人工角膜植入后临床反应及并发症,于1个月、3个月取材,石蜡包埋后,行免疫组织化学检测MMP-2、TIMP-2在不同组别的表达;RT-PCR检测MMP-2、TIMP-2 mRNA在不同时间点的表达;免疫印迹法(Western blot)检测MMP-2、TIMP-2mRNA产物在不同时间点的表达。结果:1.支架经喷砂工艺后表面变粗糙,浸入SCS溶液中,表面沉积了致密的羟基磷灰石涂层,涂层由疏松的片状外层及密集的内层组成。酸碱两步法处理喷砂后的样品避免了机械打磨,其形状保持良好,且其表面涂层晶体尺寸大,生长充分,外型的三襻结构及表面的涂层均增加了支架的表面积,使支架与组织的界面变大,增加了支架的牢固性。改良人工角膜镜柱的直径为3.2mm、厚度为3.8mm、前表面曲率半径为8.874mm。2.临床观察:人工角膜支架植入术后均不同程度地出现角膜水肿和新生血管。角膜水肿于术后1周内逐渐消退,有一例植入SB-Ti支架碱烧伤模型出现角膜溶解的并发症。术后1个月、3个月取材,组织学检查见HA/SB-Ti组界面处成纤维细胞数多于SB-Ti组,术后1个月时材料/组织界面处仍有炎症细胞存在。拉出试验测定HA/SB-Ti支架植入角膜3月后的剪切力较SB-Ti支架增强(P<0.05)。SEM检查见:钛支架被细胞外基质包裹,HA/SB-Ti支架表面有一层致密物质存在,细胞外基质在HA表面伸展良好,与HA贴附紧密,而SB-Ti组支架细胞附着量明显少。碱烧伤植入支架组中支架表面沉着的细胞外基质少于正常角膜植入支架组。TEM检查见:HA/SB-Ti支架与SB-Ti支架植入术后,支架周围的胶原纤维束紊乱,角膜基质有大量成纤维细胞,HA/SB-Ti组角膜越靠近支架中心的成纤维细胞核越圆,核仁清晰,胞浆丰富,代偿增强。碱烧伤模型组角膜基质中胶原纤维出现断裂现象,较正常兔角膜组愈合延迟。3.人工角膜镜柱二期植入后,3周后结膜充血、角膜水肿症状消失,植入改良钛支架人工角膜的动物未出现角膜溶解等并发症,1月、3月各组取材,做免疫组织化学检查,碱烧伤模型HA/SB-Ti支架植入组1月、3月MMP-2表达的平均光密度较SB-Ti支架植入组有统计学差异(P<0.01);而3月时TIMP-2表达的平均光密度HA/SB-Ti支架较SB-Ti支架无统计学差异(P>0.05);正常动物模型HA/SB-Ti支架植入组1月、3月MMP-2、TIMP-2表达的平均光密度较SB-Ti支架植入组表达弱,有统计学差异(P<0.05);于2周、1月、3月、5月取材后,做RT-PCR、Western blot检测,MMP-2mRNA及MMP-2mRNA表达产物从支架植入开始升高,1月达到高峰,然后开始下降,除2周与3月MMP-2mRNA表达产物比较无统计学意义(P>0.05)外,其余各组比较有统计学意义(P<0.05)。而TIMP-2mRNA及TIMP-2mRNA表达产物则开始有波动,然后逐渐升高,各组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:1.改良的人工角膜支架增加了表面的空隙率和表面积,增强了人工角膜在角膜中的固定。2.与单纯喷砂Ti支架相比,改良的支架增加了兔角膜基质成纤维细胞在其表面的粘附、伸展、增殖和分化的能力,促进了材料与组织界面的愈合,更适应角膜的微环境。3.改良人工角膜钛支架的活性鳞片状表面对抑制角膜组织中MMP-2过度表达与激活有积极作用,MMP-2、TIMP-2的表达在改良钛支架人工角膜植入后不同时间内差异显著,并与角膜溶解的临床病理过程具有同步性。MMP-2与TIMP-2的失衡是角膜溶解的可能原因之一,通过对MMP-2、TIMP-2的研究可为尽早解决人工角膜植入后角膜溶解穿孔提供新的途径。关于MMP-2与TIMP-2的激活和抑制的分子机制,以及如何为防治角膜溶解穿孔合理地调节二者之间的平衡有待进一步研究。

论文目录

  • 缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一部分 改良钛支架人工角膜的制备
  • 材料
  • 主要材料及仪器
  • 方法
  • 1.改良钛支架人工角膜支架的设计及制备
  • 2.改良钛支架人工角膜镜柱的设计与制备
  • 3.X射线衍射仪分析物相
  • 4.SEM观察改良的人工角膜支架表面形貌
  • 结果
  • 1.肉眼观察
  • 2.XRD结果
  • 3.SEM结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附图
  • 第二部分 人工角膜支架表面改性后植入兔角膜
  • 材料
  • 1.实验动物
  • 2.主要仪器及试剂
  • 方法
  • 1.兔角膜碱烧伤模型的建立
  • 2.表面改性的钛金属人工角膜支架植入兔角膜板层
  • 3.组织病理学检查
  • 4.拉出试验
  • 5.扫描电镜样品的制备
  • 6.透射电子显微镜标本制作
  • 结果
  • 1.临床观察
  • 2.剪切力的测定
  • 3.组织学检查
  • 4.Kpro支架扫捕电镜检查结果
  • 5.透射电镜
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附图
  • 第三部分 人工角膜镜柱二期植入及MMP-2及TIMP-2的表达
  • 材料
  • 1.实验试剂
  • 2.实验器材
  • 3.实验动物
  • 方法
  • 1.改良钛支架人工角膜镜柱二期植入
  • 2.免疫组织化学方法
  • 3.实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)
  • 4.免疫印迹法(Western-Blot)
  • 5.统计学方法
  • 结果
  • 1.临床观察
  • 2.免疫组织化学结果
  • 3.RT-PCR法检测结果
  • 4.Western bolt法检测结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附图
  • 综述 人工角膜的设计
  • 攻读学位期间发表文章情况
  • 致谢
  • 相关论文文献

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