BGT杀虫基因的原核表达、抗体制备及在转基因白桦中表达的初步研究

论文摘要

近年来植物基因工程的研究进展十分迅速,人们利用植物基因工程技术,培育出抗病毒,抗虫害,抗除草剂及抗盐,抗旱等抗逆性植物。然而,转基因植物能否长期稳定的表现出某一特定的性状,以及外源基因在转基因植物中的表达特性等问题,都需要进行详细的研究。并且,随着环境生态安全问题,日益受到人们的关注,针对一种外源蛋白,建立一种快速的检测方法是必要的。针对上述问题,本文以转基因白桦（Betula platyphylla Suk.）中蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白（BGT）基因的表达产物为研究目标,采用原核表达及纯化出融合蛋白His-BGT作为抗原,并制备出特异性的抗体。初步建立起快速酶联免疫检测技术,并对BGT基因在转基因白桦中的表达特性进行了初步的研究。本文的主要研究结果具体概述如下:1成功构建了BGT杀虫基因原核表达载体pET28a-BGT,在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效的表达,并利用金属螯合亲和层析的方法对其进行纯化,纯度可达90%以上。2利用纯化的融合蛋白His-BGT作为抗原进行兔免疫,得到相应的抗血清,采用ELISA法检测效价在1:10 000以上,并对抗血清进行了免疫亲和层析,获得了高纯度的IgG,Western blot检测具有较好的特异性。采用过碘酸钠法将抗体标记辣根过氧化物酶（HRP）,得到第二抗体即酶标抗体,标记率在85%以上。3建立了抗体-抗原-酶标抗体的抗体夹心ELISA法,并对方法进行了初步的优化。确定的抗体的最佳包被浓度为2.0μg/ml,HRP酶标抗体最适工作浓度为1:200。绘制标准曲线,对数据进行回归分析,得到了回归方程y=0.0015x-0.0694,R2=0.99,该方法最低检测限为40.0 ng/ml。初步建立起检测BGT杀虫蛋白的快速、灵敏的方法。4应用建立的检测方法,检测了5月份不同转基因白桦中BGT蛋白含量占叶片可溶性总蛋白含量的0.05～0.3%,并利用Western blot验证了方法是可靠的;同时进行了转基因白桦中BGT表达的时空性变化的检测,5～9月,大部分转基因株系叶片中BGT蛋白的含量是随着植株的生着发育呈现规律性的变化;在空间上,没有明显的规律,基本上与单株目的蛋白表达量一致。针对三种害虫舞毒蛾幼虫、天幕毛虫幼虫、分月扇舟蛾幼虫,转基因白桦均表现出抗性,对舞毒蛾幼虫的抗虫效果最强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 白桦概况
• 1.1.1 白桦的分布
• 1.1.2 白桦的经济价值
• 1.1.3 白桦转基因的概况
• 1.2 白桦转基因的概况
• 1.2.1 白桦转基因的概况
• 1.2.2 影响外源基因在转基因植物中的表达因素
• 1.3 转基因林木的生态安全性
• 1.3.1 对土壤的影响
• 1.3.2 对昆虫的影响
• 1.3.3 基因漂移
• 1.4 转基因植物外源蛋白的检测方法
• 1.4.1 生物测定法
• 1.4.2 蛋白质印迹法
• 1.4.3 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.5 转基因植物外源蛋白表达的特点
• 1.6 本实验研究的目的、意义
• 2 BGT基因原核表达载体的构建、诱导表达及纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的提取
• 2.2.2 PCR扩增目的基因
• 2.2.3 原核表达载体pET28a-BGT的构建和鉴定
• 2.2.4 阳性重组质粒在E.coli.中的诱导表达
• 2.2.5 融合蛋白的可溶性分析
• 2.2.6 融合蛋白的纯化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BGT基因的PCR扩增
• 2.3.2 表达载体pET28a-BGT的构建
• 2.3.3 重组质粒pET28a-BGT的鉴定
• 2.3.4 融合BGT蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3.5 融合蛋白的可溶性分析
• 2.3.6 融合蛋白的纯化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 原核表达载体的选择
• 2.4.2 BGT蛋白的表达、纯化
• 2.5 本章小节
• 3 抗BGT蛋白多克隆抗体和酶标抗体的（HRP）的制备与纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 抗血清的制备
• 3.2.2 抗体的纯化
• 3.2.3 Western blot检测抗体的特异性
• 3.2.4 酶标抗体的制备与纯化
• 3.2.5 酶标抗体的鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 动物免疫对多抗特性的影响
• 3.3.2 多克隆抗体纯化方法的选择
• 3.3.3 多克隆抗体标记物及标记方法的选择
• 3.4 本章小节
• 4 抗体夹心BGT-ELISA方法的建立和应用及转基因白桦抗虫性初步分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 酶标抗体工作浓度的确定
• 4.2.2 抗体包被浓度的确定
• 4.2.3 酶标反应板均一性的检测
• 4.2.4 转基因白桦总蛋白的提取
• 4.2.5 标准曲线的制作
• 4.2.6 不同转基因白桦株系BGT含量的变化
• 4.2.7 Western blot检测
• 4.2.8 转基因白桦中BGT蛋白表达特性的初步研究
• 4.2.9 转基因白桦株系的抗虫性
• 4.2.10 转基因白桦对天幕毛虫的抗虫性
• 4.3 讨论
• 4.3.1 酶标板的选择
• 4.3.2 测定方法的标准化
• 4.3.3 转基因白桦中BGT基因表达的时空变化
• 4.3.4 转基因白桦抗虫性
• 4.4 本章小节
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢