论文摘要
丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）为正链RNA病毒,已知其基因组两端的非编码区（non-coding region,NCR,又称为非翻译区UTR）对病毒翻译复制十分重要,其中3’NCR区为病毒RNA复制起始区,且能增强病毒IRES介导的翻译,已发现多种细胞蛋白可以与其结合从而参与调节HCV复制、翻译,而对其互补链5’（-）NCR的研究目前几乎空白。为发现新的与HCV 3’NCR及其互补链5’（-）NCR结合的细胞蛋白,本研究利用体外转录并标记生物素的上述RNA片段对能支持HCV有效复制的Huh7细胞的胞浆蛋白组分S10进行RNA pull-down实验;随后利用蛋白质一维SDS-PAGE电泳结合液相色谱-质谱联用（1DE/LC/MS）以及二维电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（2DE/MALDI-TOF-MS）两种方法对得到的蛋白复合物进行全面的分析,获得了结合蛋白谱;综合分析上述结合蛋白谱,在去除载体RNA对照组中也出现的非特异性结合蛋白后,共有10个特异性结合蛋白同时为两种鉴定方法所发现,包括6个HCV 3’NCR结合蛋白、3个5’（-）NCR结合蛋白以及同时结合这两个RNA片段的DDX1蛋白;对其中的5’（-）NCR结合蛋白G3BP1、3’NCR结合蛋白PCBP2以及DDX1设计特异性siRNA,在复制子中分别干扰它们的表达后观察对HCV复制的影响,发现G3BP1表达降低后HCVRNA及蛋白水平均有明显下降（分别降低约55%和57%）,提示该蛋白可能参与HCV复制。因此本研究对G3BP1调控HCV复制进行了深入研究。首先确认G3BP1与HCV 5’（-）NCR RNA的相互作用并分析结合位点:通过RNA pull-down实验证实G3BP1可与HCV 5’（-）NCR结合并发现5’（-）NCR最前端98nt的保守区含有G3BP1的结合位点;进一步构建了G3BP1 C端RNA结合功能域缺失的截短突变体,研究它们同HCV 5’（-）NCR RNA的结合情况,结果显示G3BP1通过其C端的RNA结合域RRM和RGG box结合HCV 5’（-）NCR RNA。随后通过一系列实验从多个方面证实G3BP1为HCV复制复合体（HCVreplication complexes,HCV RC）成分,在细胞内同样可能结合HCV负链5’（-）NCR:免疫共沉淀实验发现单独表达时G3BP1只同HCV NS5B共沉而不结合NS3及NS5A,但在复制子细胞中G3BP1可以将上述三个HCV RC成分蛋白都共沉淀;免疫荧光共聚焦实验发现复制子中G3BP1同HCV RC成分蛋白NS5A共定位且呈脂滴状分布于近核周,与文献报道的HCV RC分布情况一致;用脂筏删除试剂mβCD处理细胞使HCV RC解离后G3BP1同NS5A的共定位也随之消失;蛋白酶K处理实验证实复制子中G3BP1同HCV RC成分蛋白具有相同特性,可以耐受蛋白酶K处理,进一步提示G3BP1为HCV复制复合体一部分。为验证G3BP1在HCV复制中的作用,进一步用特异性siRNA抑制G3BP1在不同细胞中的表达,HCV亚基因组复制子克隆形成实验以及HCV感染性颗粒（HCVcc）感染实验均证实:当siRNA干扰了细胞中G3BP1的表达后HCV复制几乎全部被抑制。随后构建了一系列G3BP1各功能域缺失的截短突变体,在亚基因组复制子以及HCVcc系统中观察这些突变体对HCV复制的影响。结果显示G3BP1 C端RNA结合域RRM和RGGbox是其参与HCV复制所需的。此外,应用IRES介导的报告基因系统发现si-G3BP1并不影响HCV IRES介导的翻译。上述结果从功能学角度进一步证明G3BP1是HCV复制复合体成分,为HCV复制所必需。最后对G3BP1参与HCV RNA复制进行了初步研究:在siRNA干扰G3BP1表达后的细胞中电转HCV BB7亚基因组复制子RNA或感染HCVcc,不同时间点检测HCV正负链RNA累积情况,结果提示G3BP1可能在HCV负链合成过程中起促进作用。综上所述,本文利用RNA pull-down结合生物质谱的方法发现了数个新的与HCV 3’NCR及其互补链5’（-）NCR特异性结合的细胞蛋白;在确认G3BP1同5’（-）NCR相互作用的基础上深入研究了G3BP1参与HCV复制的机制,为进一步了解HCV复制机制和研制抗HCV药物打下了良好的基础。
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标签：丙型肝炎病毒论文; 基因组非编码区论文; 细胞蛋白论文; 基因组非编码区互补链论文; 复制复合体论文;