TLR4信号通路在胆囊癌中的表达及其作用机制的初步研究

论文摘要

研究目的胆囊癌是肝胆外科的常见恶性肿瘤之一,其起源于胆囊内皮细胞,恶性程度较高,早期诊断困难,并且容易局部浸润扩散及沿血管、神经及淋巴管形成远处转移。在现有的治疗方法中,手术是唯一可能治愈胆囊癌的手段,但由于大部分病人发现肿瘤时病情已为中晚期,导致大部分手术的切除率低且术后容易复发。放化疗对于胆囊癌病人而言也没有明显作用,无助于生存率的提高。总体而言现阶段尚缺乏对胆囊癌的早期诊断和有效治疗手段。现代医学认为肿瘤的发生发展是一个复杂的网络系统,干预其中某一个重要环节就能够改变其进程,达到预防和治疗的目的。流行病学调查发现胆囊癌发病的高危因素是胆囊的慢性炎症,TLR4 （Toll like receptor 4）作为Toll样受体家族中的一员,不仅参与介导免疫应答、炎症反应,还在多种肿瘤细胞的发生发展中起到了重要作用。TLR4在肿瘤细胞中的作用可能与环氧合酶-2（cyclooxygenase2,COX-2）密切相关,而COX-2在部分肿瘤的临床及基础研究中已经被证实是一个重要的相关指标。本课题正是以胆囊癌与慢性炎症紧密关联的病理特点为基础,着眼于TLR4信号通路在炎症系统及肿瘤发展中的重要作用,通过体内和体外实验观察胆囊癌TLR4信号表达情况及对下游COX-2的影响,利用TLR4靶向性小干扰RNA技术阻断TLR4信号通路,观察其对胆囊癌细胞的作用,以期为胆囊癌的基因治疗寻找新的有效靶点。目的研究TLR4在胆囊组织中的表达情况及其与下游基因COX-2的关系,揭示其在胆囊癌发生发展中的可能作用。应用小干扰RNA抑制胆囊癌细胞TLR4的表达,研究阻断TLR4信号通路后TLR4及COX-2基因蛋白表达情况和体内外抑制胆囊癌细胞增殖的效果。从而探究以TLR4作为潜在靶点的基因治疗在胆囊癌中的可行性,为临床胆囊癌的治疗摸索新方法。方法临床收集胆囊癌组织标本13例、慢性胆囊炎组织标本30例及正常胆囊组织标本l0例,分别应用免疫组化法、聚合酶链反应和免疫印迹技术检测以上标本中TLR4与COX-2的表达情况。体外实验中,利用SGC996胆囊癌细胞系,经过RNA干扰抑制TLR4表达,以免疫荧光染色检测阻断效果,连续观察阻断前后胆囊癌细胞增殖情况,分析TLR4对胆囊癌细胞体外增殖的影响。随后应用蛋白免疫印迹和聚合酶链反应研究TLR4对下游基因COX-2的影响作用。最后,通过建立胆囊癌裸鼠皮下移植瘤模型,使用以TLR4为靶点的小干扰RNA进行治疗实验,观察体内情况下通过抑制TLR4对移植瘤生长所产生的影响。结果胆囊组织标本经过免疫组化检测结果显示TLR4主要表达于胆囊及腺体的上皮细胞。TLR4在胆囊癌组织中的表达水平明显弱于正常胆囊组织及慢性胆囊炎组织（P<0.05）,而COX-2在胆囊癌与慢性胆囊炎组织中的表达水平要强于正常胆囊组织（P<0.05）。细胞免疫荧光、聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测结果显示体外设计合成的TLR4靶向小干扰RNA转染胆囊癌SGC996细胞后能有效抑制TLR4表达,转染后胆囊癌细胞的增殖活性受到抑制。而且随着TLR4的抑制,COX-2的表达亦随之下降。我们在动物实验中成功建立了裸鼠的人胆囊癌细胞SGC996皮下移植瘤模型。在成瘤能力上,经TLR4靶向RNA干扰后的肿瘤体积和重量均明显小于对照组（P<0.05）。在治疗实验中,以TLR4为靶点的小干扰RNA注射组肿瘤的平均体积和重量与阴性对照组和空白对照组间无明显差异（P>0.05）,不能起到阻断TLR4表达的作用。结论TLR4和COX-2表达于人胆囊组织及SGC996细胞,并与胆囊癌的发生发展密切相关。在胆囊癌SGC996细胞中,靶向TLR4的小干扰RNA能够有效抑制SGC996细胞增殖,同时导致COX-2表达下调。在胆囊癌SGC996细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,以TLR4为靶点的小干扰RNA能明显抑制肿瘤生长。综和以上结果,我们认为TLR4可能是胆囊癌基因治疗的潜在有效靶点。而以TLR4为靶点的小干扰RNA技术可能成为临床上炎症相关性胆囊癌的潜在治疗手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要英文缩写
• 绪论
• 研究背景
• 课题设计
• 课题内容
• 参考文献
• 第一部分 人胆囊组织中TLR4与COX-2的表达
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 TLR4靶向siRNA体外抑制胆囊癌细胞及对COX-2的影响作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 靶向TLR4-siRNA对体内胆囊癌裸鼠移植瘤影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述 Toll样受体与肿瘤
• 参考文献
• 附件一 在读期间发表论文情况
• 致谢