岛叶点燃癫痫大鼠海马Arc、BDNF、TrkB表达及其与学习记忆的关系研究

论文摘要

目的电刺激Sprague-Dawley大鼠岛叶,建立慢性电点燃癫痫模型,通过避暗试验观察癫痫大鼠不同时间段学习记忆功能,检测活性骨架调节蛋白（Arc）、脑源性神经营养因子（BDNF）、酪氨酸蛋白激酶受体B（TrkB）在岛叶慢性电点燃癫痫大鼠海马组织中表达,探讨Arc、BDNF、Trkb与学习记忆之间的关系。方法1.岛叶慢性电点燃癫痫模型建立与学习记忆相关性研究:健康雄性SD大鼠216只,随机分为岛叶点燃组、假手术对照组及空白对照组,假手术组大鼠只植入电极及测定后发放阈,不行电刺激点燃。点燃组建立岛叶慢性电点燃模型。点燃组分0周、1周、2周、3周、4周几个亚组。观察各组大鼠行为学改变及脑电生理变化,采用避暗试验方法记录各组大鼠潜伏期（LT）及穿梭次数（EN）,研究其学习记忆变化。2.大鼠海马Arc、BDNF、TrkB的表达与学习以及的关系:大鼠单笼饲养,避暗试验后,无外界刺激无痛处死假手术对照组及空白对照组大鼠,每组取大鼠n=12只。点燃组每亚组避暗试验后于1h、3h、6h、12h、24h等不同时间点无痛处死大鼠,每时间点取大鼠n=12只;取1h、3h、6h、12h等时间检测Arc表达,取1h、12h、24h等时间检测BDNF、TrkB表达。每组大鼠一半用乙醚麻醉后断头取脑,迅速取出海马组织,分别放于冻存管中,置于液氮后再移至-80℃冰箱以备用,另一半经乙醚麻醉后用4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液分别梯度过夜脱水,应用OTC（Sakura, USA）包埋,-80℃冰箱保存以备组织切片用。标本应用免疫组化、RT-PCR和western blot等技术方法研究岛叶电点燃致癫大鼠海马Arc、BDNF、TrkB mRNA及蛋白的表达并探讨与学习记忆的关系。结果1、岛叶慢性点燃后大鼠自行癫痫发作,检测大鼠脑电波可收集典型的癫痫脑电波模型。模型制作点燃成功率为92.4%。空白组避暗试验结果LT为（55.00±2.83s）、EN为（3.33±1.02次）,假手术组避暗试验结果LT为（54.67±2.73s）、EN为（3.33±1.05次）,点燃组:点燃0周（即点燃当天至点燃第七天）避暗试验结果LT为（56.25±2.01s）、EN为（3.42±0.93次）;点燃1周避暗试验的结果LT（54.83±2.82s）、EN为（3.33±1.04次）;点燃2周避暗试验结果的LT为（48.87±3.42s）、EN为（2.75±0.99次）;点燃3周避暗试验结果的LT为（48.71±2.77s）、EN为（2.75±1.15次）;点燃4周避暗试验的结果为LT（37.54±1.59s）、EN为（6.75±1.29次）。点燃2周、3周组与对照组相比学习记忆能力增强（P<0.05）,点燃4周与对照组比学习记忆能力明显下降（P<0.05）。假手术对照组与空白对照组间差异无统计学意义。2、分子生物学检测显示:（1）免疫组织化学结果:Arc免疫组织化学染色阳性结果表现为海马细胞胞质成棕黄色,BDNF免疫组织化学染色阳性结果表现为海马细胞胞质成棕黄色,TrkB为胞膜呈棕黄色。阳性细胞百分率点燃组与假手术对照组及空白对照组有明显差异（P<0.05）,点燃组明显高于对照组。点燃组内比较,阳性细胞百分率点燃2周、3周组时明显高于0周、1周、4周组,4周组最低（P<0.05）;各亚组各个时间点检测中,Arc为6h达到高峰,BDNF、TrkB均为24h达到高峰,在2周、3周组峰值均最高（P<0.01）,4周峰值均最低（P<0.01）。（2）RT-PCR结果:在maker的对照下目的条带清晰可见,通过测定各条带的光密度值,与GADPH管家基因比值校对,点燃组与假手术对照组及空白对照组有明显差异（P<0.05）,点燃组明显高于对照组。点燃组内比较,光密度校对值点燃2周、3周组时明显高于0周、1周、4周组,4周组最低（P<0.05）;各亚组各个时间点检测中,Arc（扩增出片段为77bp）为6h达到高峰,BDNF（扩增出片段为533bp）、TrkB（扩增出片段为248bp）均为24h达到高峰,在2周、3周组峰值均最高（P<0.01）,在4周峰值均最低（P<0.01）。（3）Western blot印迹结果:各个组大鼠海马中Arc、BDNF、TrkB蛋白均有表达,在标准蛋白分子参照物maker的对照下,通过测定各目的条带的光密度值,与β-actin管家基因蛋白比值校对,点燃组与假手术对照组及空白对照组有明显差异（P<0.05）,点燃组明显高于对照组。点燃组内比较,光密度校对值点燃2周、3周组时明显高于0周、1周及4周组,4周组最低（P<0.05）;各亚组各个时间点检测中,Arc（分子量为:55KD）为6h达到高峰,BDNF（分子量为:14KD）、TrkB（分子量为:145KD）均为24h达到高峰,在2周、周组峰值均最高（P<0.01）,在4周峰值均最低（P<0.01）。结论1、慢性电刺激大鼠岛叶成功建立了慢性癫痫点燃模型,通过行为学观察及大鼠脑电生理检测,证实了岛叶是癫痫发作的一种致痫源。2.岛叶点燃癫痫模型大鼠在不同时间段学习记忆功能不同,证明慢性岛叶癫痫大鼠学习记忆等认知功能受损。且进一步证明了岛叶癫痫与海马关系密切,海马在岛叶点燃癫痫模型中起着非常重要的作用。3.Arc、BDNF和TrkB可能参与了岛叶癫痫的学习记忆功能,是学习记忆的重要分子基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 前言
• 一、大鼠岛叶慢性电点燃癫痫模型的建立及学习记忆功能研究
• 材料与方法
• 结果
• 二、岛叶癫痫大鼠海马 Arc、BDNF 及 TrkB 的表达及学习记忆相关性研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结 论
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文目录