松材线虫纤维素酶特异性研究

论文摘要

本研究以采自浙江省松材线虫病疫区黑松、马尾松样品中分离得到松材线虫为研究对象，分析松材线虫病检测过程中可能作为特异性检测信号的松材线虫纤维素酶的活力和酶学性质，并通过与试验筛选出的微生物所分泌的纤维素酶进行对比，判断其作为松材线虫病检测特异性信号可行性的基础性研究。通过试验测试证明，松材线虫纤维素酶与试验筛选出的微生物所分泌的纤维素酶，在酶促反应最适温度、酶促反应最适pH值、金属离子对酶活力影响以及分子量大小方面均有明显差异。本研究取得的主要结果如下：1．从浙江省松材线虫病疫区共采集黑松、马尾松样品26个，实验室分离样品中的真菌，得到菌株307株，已鉴定出的158株菌株包括木霉属Trichoderma、青霉属Penicillium、葡萄座腔菌属Botryosphaeria、盘多毛孢属Pestalotia、胶帚霉属Gliocladium、曲霉属Aspergillus、短梗霉属Aureobasidium、长喙壳属Ceratocystis、球壳孢属Sphaeropsis、枝顶孢霉属Acremonium，其中以木霉属、青霉属、曲霉属和葡萄座腔菌属为优势属。用刚果红染色法在松材线虫悬液以及离心后不含松材线虫的上清液中均检测出了纤维素酶活性。对已鉴定出的158株菌株进行染色，结果显示96株为产酶菌株。经鉴定这些真菌分别属于木霉属Trichoderma、青霉属Penicillium和曲霉属Aspergillus。实验室分离得到的细菌经产酶检测未见可以分泌纤维素酶的种类。2．对比松材线虫纤维素酶和7种真菌纤维素酶的活力和酶学性质发现：除变色青霉外其他真菌纤维素酶C1酶活力均低于松材线虫；松材线虫纤维素酶测得最高酶活力的反应温度比真菌纤维素酶低5℃左右；松材线虫CX酶酶促反应最适pH比真菌CX酶高1～1.5个单位。K+、Ba2+、Zn2+和Al3+离子对松材线虫纤维素酶和真菌纤维素酶活力的影响有明显差异。分析SDS-聚丙烯胺凝胶电泳结果发现，松材线虫纤维素酶CX酶和C1酶的相对分子量为29Kd和59Kd，均大于真菌纤维素酶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 国内外研究现状与评述
• 1.2.1 松材线虫病的发生及危害情况概述
• 1.2.2 松材线虫病致病机理研究进展
• 1.2.3 松材线虫病诊断技术研究进展
• 1.2.4 松材线虫纤维素酶研究进展
• 1.2.5 研究评述
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 第二章 研究材料与方法
• 2.1 野外试验材料与方法
• 2.1.1 样品采集地概况
• 2.1.2 样品采集方法
• 2.2 样品的室内分离
• 2.2.1 线虫的分离
• 2.2.2 真菌的分离
• 2.2.3 细菌的分离
• 2.3 试验样品的纯化与鉴定
• 2.3.1 线虫的纯化与鉴定
• 2.3.2 真菌的纯化与鉴定
• 2.3.3 细菌的纯化与鉴定
• 2.4 松材线虫和微生物的显色反应
• 2.4.1 反应原理与操作方法
• 2.4.2 产酶微生物的筛选
• 2.5 真菌和细菌的发酵产酶培养
• 2.5.1 产酶培养基的配制
• 2.5.2 发酵产酶培养
• 2.6 纤维素酶的提取与纯化
• 2.6.1 微生物分泌的纤维素酶的提取与纯化
• 2.6.2 松材线虫分泌的纤维素酶的提取与纯化
• 2.7 松材线虫纤维素酶的酶学性质测定
• 2.7.1 纤维素酶活力测定
• 2.7.2 酶学性质测定
• 2.8 产酶真菌纤维素酶的酶学性质
• 2.8.1 纤维素酶活力测定
• 2.8.2 酶学性质测定
• 2.9 纤维素酶 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳分析
• 2.9.1 实验材料与试剂
• 2.9.2 主要仪器
• 2.9.3 方法与步骤
• 第三章 结果与分析
• 3.1 样品分离的结果与分析
• 3.1.1 样品分离的结果
• 3.1.2 分离结果的分析
• 3.1.3 小结
• 3.2 松材线虫产酶染色和真菌产酶菌株筛选的结果与分析
• 3.2.1 试验结果
• 3.2.2 试验结果分析
• 3.2.3 小结
• 3.3 松材线虫纤维素酶活力和性质测定结果与分析
• 3.3.1 松材线虫纤维素酶活力测定结果
• 3.3.2 松材线虫纤维素酶酶学性质测定结果
• 3.3.3 结果分析
• 3.3.4 小结
• 3.4 真菌纤维素酶活力和性质测定结果与分析
• 3.4.1 真菌纤维素酶活力测定结果
• 3.4.2 真菌纤维素酶性质测定结果
• 3.4.3 结果分析
• 3.4.4 小结
• 3.5 纤维素酶 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳结果与分析
• 3.5.1 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳结果
• 3.5.2 结果分析
• 3.5.3 小结
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 纤维素酶活力比较
• 4.1.2 酶学性质比较
• 4.1.3 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳比较
• 4.2 讨论
• 4.2.1 产酶培养方法
• 4.2.2 纤维素酶活力和性质的测定
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢