持续机械刺激对大鼠背根神经节TRPV4通道的影响和差异蛋白质组学研究

论文摘要

第一部分:大鼠背根神经节机械敏感性离子通道电生理性质的研究背景当活细胞和有机体受到环境中的机械刺激时,机械信号随即转化成生物信号,使细胞作出适当反应,此过程被称为机械转导。在机械信号转导过程中,机械敏感性离子通道（mechanosensitive channel,MS通道）起了很重要作用。MS通道是一类通道开放概率随细胞膜张力变化呈现相应变化的离子通道,能够将施加在分子膜上的机械信号转换成电信号或生化信号。自从在鸡胚骨骼肌细胞和蛙肌肉上发现MS通道以来,在许多类型的细胞上都发现了MS通道。1999年,McCarter首次在大鼠背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）上发现了机械敏感性全细胞电流,随后有研究小组使用不同的刺激方法在DRG上记录到了几种MS通道,由于细胞类型,刺激方法,记录方法和电极液、浴液成分的不同,这些通道的电生理性质不完全相同,也无法确定是否是同样的通道。DRG是躯体感觉初级传入神经元细胞体的聚集处,由于其特殊的解剖位置和生理结构特点,易于受到机械压迫刺激,从而产生根性疼痛。但这种病理性疼痛的电生理机制尚不明确。研究大鼠DRG神经元细胞膜上的MS通道的生物物理学特性及通道的分布,可为进一步了解DRG神经元细胞电活动的机制提供依据。目的研究大鼠DRG神经元细胞膜上的MS通道的生物物理学特性及通道的分布。方法将新生大鼠DRG细胞培养4天后,应用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术记录细胞膜上的MS通道电流,分析通道的电生理性质,如压力-电流关系、电压-电流关系,开放动力学,离子选择性,影响因素和通道在DRG细胞上的分布。本试验采用的机械刺激方式为负压抽吸。结果1.压力-电流关系操纵微电极接近DRG神经元,形成细胞贴附式膜片钳记录方式,保持膜电压（membrane voltage,Vm）为-60mV,在未施加负压时,通道的自发性开放很少。逐渐增大所施负压的值,当负压为-12～-15mmHg时,开始出现内向电流。细胞膜能承受的最大负压约为-50mmHg,更大的负压可以破坏细胞膜。P1/2=36.66±0.455mmHg（n=25）。Vm=-60mV时的平均幅度为-3.40±0.04pA（n=125）。同一电压下,随压力的增大,通道开放概率（NPo）逐渐增大（P＜0.01,n=25）,但不同压力产生的电流的幅度无差别（P＞0.05,n=25）。同一电压下,细胞贴附式记录方式,Vm=-60mV,在-50mmHg负压下,平均NPo为0.448±0.03（n=25）。2.电压-电流关系形成内面向外式膜片钳记录方式,在持续施加负压-40mmHg,在膜电压为正值时,表现为外向电流,+60mV时电流的弦电导为96.15±3.734 pS（+40～+60mV）。当膜电压为负值时,表现为内向电流,同时表现出内向整流特性,内向电流（-60～0mV）的斜率电导为62.47±2.72 pS。平衡溶液中,平均逆转电位Erev=-2.33±0.255mV。3.通道动力学形成内面向外式膜片钳记录方式,Vm=-60mV,当负压为-20mmHg时,双指数拟合所得两个开放常数分别为1.338±0.098ms和13.001±0.649ms,关闭常数分别为2.462±0.267ms和23.386±1.206ms。当负压为-40mmHg时,短开放时间常数和长开放时间常数分别变为1.744±0.195ms和17.92±1.623ms,明显高于-20mmHg压力下的时间常数（both P＜0.05）。此时的短关闭时间常数和长关闭时间常数分别变为2.266±0.154 ms和14.071±0.797ms。与负压为-20mmHg时相比,长关闭时间常数明显减少（P＜0.05）,短关闭时间变化不大（P=0.545）,可见压力是通过增加开放时间和减少长关闭时间来增加通道的活性的。4.离子选择性本研究记录到的通道为非选择性阳离子通道,对阴离子没有通透性。5.影响因素该通道对机械刺激的反应可被钆和秋水仙素阻断,河豚毒素可阻断大直径神经元上的电流,对小直径细胞无效。阿米洛利对该电流无效。6.MS通道的分布该通道多位于小直径（＜20μm,48.41%）和中等直径（20～30μm,36.30%）神经元上,而在大直径神经元上存在较少（＞30μm,15.29%）。结论本部分试验研究了大鼠DRG上MS通道的电导、开放动力学、离子选择性等电生理性质及通道在DRG上的分布。机械刺激可使DRG神经元膜上的MS通道开放,产生电流,传导机械信号。背景各种原因导致的背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）及周围神经根的持续受压被认为是放射性痛最常见的病因之一。但是由于体内环境的复杂性，单纯机械压迫对神经元的影响至今尚不清楚。目前通常使用在体模型来研究持续机械刺激对DRG的形态、功能、电生理性质、相关基因和蛋白的表达的影响。但在体机械压迫通常会伴随继发性的炎症反应，如缺血、水肿及各种炎性细胞的浸润，使我们无法区分出单独机械刺激的作用。因而有必要建立一种简便、可靠、稳定、研究因素单一的细胞模型，以排除其他因素的影响，明确单纯机械压力对DRG神经元的作用。在目前已有的各种体外加压模型中，静水压模型可以提供持续的机械压迫。这种方法通过向密闭的培养室内注入混合气体，使培养室内的细胞受压。但是由于神经元细胞培养的特殊性，我们必须验证该模型对神经元的形态和活性是否有影响，并确定合适的培养压力和时间。DRG神经元细胞膜上存在多种可能参与机械觉传导的离子通道，如transient receptor potential vanilloid receptor 1（TRPV1），transient receptor potential vanilloid receptor 4（TRPV4），transient receptor potential channel of melastatin type 8（TRPM8）和transient receptor potential subtype ankyrin 1（TRPA1）等。其中，香草素受体亚家族TRPV4是一种多觉感受器，参与了渗透压和伤害性机械刺激信号的传导。但持续的机械刺激对这些离子通道的影响尚不明确。研究显示持续压迫DRG可以改变多种离子通道的表达或电生理性质，影响神经递质的合成等。对自发性高血压大鼠的研究也显示，持续的血管壁高张力可明显增加血管壁上压力激活性离子通道的密度。所以我们设想，持续的机械压力或许会影响DRG上的机械感受器的表达和性质。目标1．建立DRG持续受压体外模型，确定合适的培养压力和时间。2。观察持续机械压力对DRG神经元细胞膜上各种与机械传导相关的离子通道，特别是TRPV4通道的表达和性质的影响。方法1．建立加压培养细胞模型DRG取材及细胞培养同论文第一部分。37℃培养2天后换1次培养液，然后将细胞分为12h，24h，48h和72h组，分别放入密封加压培养装置中，通过向容器内输入混合气体，使容器内压力高于大气压。分别使用0mmHg（即正常大气压，作为对照），20mmHg，40mmHg，80 mmHg和120 mmHg压力培养。2．MTT法测定细胞活性将DRG神经元以1×104／孔的密度接种于96孔培养板，在不同压力下培养不同时间之后，加入MTT，在酶标检测仪上测定波长490nm处吸光度OD值，各组均以0mmHg压力下培养的DRG的吸光度作为100％，其他各压力下的OD值与之相比较。3．实时定量PCR检测从各组细胞中提取RNA，使用实时定量PCR检测TRPV4基因表达的变化。4。Western blotting检测从各组细胞中提取蛋白质，使用Western blotting分别检测TRPV1、TRPV4、TRPM8和TRPA1的蛋白质表达量的变化。5．激光共聚焦检测使用激光共聚焦检测低渗溶液，激动剂和阻断剂引起DRG神经元内钙离子浓度的变化。并比较不同压力和不同培养时间对钙离子浓度变化的影响。结果1．加压模型的建立各个组之间细胞形态未见的明显差异，说明持续机械压力不会影响细胞的形态。MTT分析显示120 mmHg的压力可以明显抑制48h和72h组细胞的活性（bothP<0．01），而且对72h组的抑制作用更强（P<0．01）。在72h组，40mmHg和80mmHg的压力均可抑制DRG的活性（both P<0．01）。在其他的培养组中，除120 mmHg外，各种压力强度下细胞的活性相类似。而且，由于80mmHg的压力更接近于病理状态下DRG所受的压力，所以我们后面的研究均采用80mmHg作为压力强度，培养时间选用24h和48h。2．持续压力对TPRV4基因表达的影响持续压力可明显增加TRPV4 mRNA的表达（P<0．05）。随受压时间的延长，TRPV4 mRNA的表达逐渐增高，与对照组相比，80mmHg压力下培养24h和48h后，TRPV4mRNA的表达分别增加为各自0mmHg压力对照组的2．31和4．04倍，差异有统计学意义（both P<0．05，SNK）。同时，受压48h组TRPV4 mRNA的表达也明显高于受压24h组（P<0．05，SNK）。3．持续压力对机械感受相关离子通道蛋白质表达的影响持续压力可明显增加TRPV4蛋白的表达（P<0．05）。随受压时间的延长，TRPV4蛋白的表达逐渐增高，受压24h和48h后分别升高至为对照组的1．80和4．22倍，差异有统计学意义（both P<0．05，Tukey Test）。TRP家族其他离子通道，如TRPV1，TRPM8和TRPA1，受压前后蛋白的表达未见明显变化（all P>0．05）。4．持续压力对TRPV4通道性质的影响持续压力可以明显增加低渗溶液和佛波醇引起的细胞内钙浓度的增加fbothP<0．05)。在正常培养组，30％的低渗溶液可以引起37．0％的DRG细胞内钙浓度增加，峰值为1．67+0．02。80mmHg压力下培养24h和48h后，峰值增加至各自对照组的1．74和2．52倍（both P<0．01，SNK），对低渗溶液产生反应的DRG细胞比例数也升高（48．4％，X2=1．86，P>0．05 for 24h group and 61．2％，X2=7．16，P<0．05for 48h group）。与低渗引起的反应相类似，受压培养24h和48h后，佛波醇引起的细胞内钙浓度的峰值分别为对照组的1．48和2．09倍（Fig 2-8 C．both P<0．01．SNK），产生反应的DRG细胞比例数也升高，从30．92％升高到42．25％（X2=2．29，P>0．05 for 24 hgroup）和49．18％（X2=5．30，P<0．05 for48hgroup）。结论1．在一定的压力强度和培养时间内，持续加压培养不会对DRG神经元形态和细胞活性产生显著影响，此模型可观察单纯机械刺激因素对神经元的影响，可以成为一种研究机械压力对DRG神经元的影响的有效体外模型。2．体外单独的机械刺激可以增加TPRV4基因和蛋白的表达，敏化通道功能，而对TRP家族其他离子通道无明显影响。背景背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）的持续受压（chronic compression of DRG CCD）可以产生自发性疼痛，机械痛觉过敏和异常疼痛，伴随着神经元的自发性放电增加，动作电位和电流阈值降低。多种离子通道被认为与持续受压后DRG的高兴奋性有关，如电压门控性Na+通道和K+通道，超极化激活性阳离子通道等，但CCD导致的机械痛觉过敏和异常疼痛的分子基础还不甚清楚。DRG上存在多种离子通道，其中瞬时感受器电位离子通道家族中香草素受体亚家族TRPV2，TRPV4和锚蛋白亚家族TRPA1都被认为与机械性疼痛有关。其中TRPV4的作用越来越受到关注。TRPV4为多觉感受器，试验证据支持TRPV4参与多种病理状态下，如炎性因子或者化疗导致的炎性痛模型，机械痛敏的传导。不同病理模型中，TRPV4表达和功能的变化也不完全相同。在化疗导致炎性痛模型中，对TRPV4激动剂产生反应的DRG神经元的比例数增加。但在外伤性或糖尿病性神经痛模型中，TRPV4的表达无明显变化。我们第二部分的试验已经证明持续的机械刺激可以增加TPRV4的表达和功能。CCD模型中，机械压迫通常会伴随继发性的炎症反应，缺血、水肿及各种炎性细胞的浸润，病理生理环境变化比体外单独的械刺激更加复杂。所以，本部分的研究目的是观察CCD对TRPV4基因、蛋白表达及功能的影响，明确TRPV4在CCD导致的机械性异常疼痛中的作用。目的1．观察CCD对TRPV4基因、蛋白表达及功能的影响。2．明确TRPV4是否参与CCD导致的机械性异常疼痛。方法1．CCD模型的建立99只大鼠随机分成7天组，14天组和28天组，每组均33只大鼠。每个组又分成CCD（n=20）和假手术（n=13）2个亚组。大鼠麻醉后，将“U”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内，使之挤压L4、L5 DRG。假手术组除不插钢棒压迫神经节外，其余操作同手术组。分别于术后7天，14天和28天处死动物。2．TRPV4翻译核苷酸干扰为了测量TRPV4反义核苷酸干扰对机械痛阂值的影响，45只大鼠被随机分为正常组（normal mt，n=18）和CCD（CCD rat，n=27）组，每个组又分成对照组（contr01），反义核苷酸干扰组（antisense ODN group，AS group）和错配组（mismatchODN group，MM group）等3个亚组。正常组大鼠每个亚组n=6，CCD组大鼠每个亚组n=9。正常组中未接受任何处理的大鼠作为对照，CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。ODN注入蛛网膜下腔，40μg／d，每天一次，共7天。CCD组于手术12h后进行第一次注射。7天后处死动物，取出DRG。3．神经行为学测定分别于手术前及手术后7天、14天及28天取材前进行。1)运动功能（motor function）观察动物自然状态下随意行走的步态，采用记分制：1分=正常步态、足无畸形：2分=正常步态伴明显足畸形；3分=轻度步态障碍伴足下垂；4分=严重步态障碍伴肌无力。2)机械痛阈值（Mechanical withdrawal threshold，MWT）MWT的测量使用BME-403型VonFrey Monofilaments机械痛刺激仪。将大鼠放在铁丝网上，从低到高依次使用各种强度的Von Frey针丝，刺激动物手术侧足底3、4趾间皮肤，缩爪或舔足为阳性反应。每根针丝测量5次，至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。4。实时定量PCR检测从各组大鼠DRG中提取RNA，实时定量PCR检测TRPV4基因表达的变化。5．Westernblotting检测从各组大鼠DRG中提取蛋白质，Western blotting检测TRPV4蛋白质表达量的变化。6．激光共聚焦检测使用激光共聚焦检测低渗溶液和佛波醇刺激DRG神经元后，细胞内钙离子浓度的变化。并比较各组问的差别。结果1．行为学测定1)运动功能所有动物在损伤前后步态均正常，足无畸形，评分均为1分，损伤前、后各组间无显著性意义。2)机械痛阈值手术前，各组大鼠的机械缩爪阈基础值无差别（F=1．63，P=-0．16）。与假手术大鼠相比，持续压迫明显降低大鼠的机械痛阈（P<0．001）。手术后7，14和28天的机械痛阈值也存在明显差别（P<0．001）。手术处理与术后天数存在交互作用（P<0．05）。与假手术组相比，手术后机械痛阈值下降，7天达到最低，然后逐渐上升，但术后28天机械痛阈值仍明显低于假手术大鼠（SNK，all P<0．05）。2．实时定量PCR测量受压前后TRPV4基因的变化持续机械压迫可以明显增加TRPV4基因的表达（P<O．001）。手术后7天，14天和28天，TRPV4 mRNA的表达分别为假手术大鼠的4．29倍，2．95倍和2．48倍，差异有统计学意义（SNK，all P<0．05）。而假手术大鼠之间无明显差别（F=0．155，P--0．859）。3．Western blotting测量TRPV4蛋白质的变化蛋白质的变化与mRNA的变化相类似，持续机械压迫可以明显增加TRPV4蛋白的表达（P<0．001）。压迫7天后，TRPV4的表达明显增高，为假手术的4．34倍，。随受压时间的延长，TRPV4蛋白的表达逐渐降低，术后14天和28天分别为假手术的3．88和2．47倍，差异有统计学意义（SNK，all P<0．05）。假手术组之间没有明显差别（F=1．21，P=0．412）。4．持续压迫导致的病理性疼痛与TRPV4在正常组和CCD组，反义寡脱氧核苷酸可明显抑制TRPV4的合成，但错配寡脱氧核苷酸无明显影响。在正常组，干扰前后大鼠机械痛阈值无变化（尸=0．93）。在CCD组，三个组的基础机械痛阈值无差别（P=0．844）。与基础痛阈值相比，对照组和MM组的机械痛阈值明显下降（Bonferronit-test，both P<0．05）。而在AS组，CCD导致的机械痛阈值降低被部分逆转（Bonferroni t-test，P>0．05）。5．持续神经节压迫对TRPV4通道功能的影响TRPV4的基本性质与细胞模型结果相同。持续压迫7天后，30％低渗溶液和佛波醇引起的细胞内钙浓度的峰值产生明显变化（both P<0．01）。与假手术组相比，30％低渗溶液引起的CCD组和MM组钙浓度的峰值明显增加（Tukey Test，both P<0．01），对低渗溶液产生反应的DRG细胞比例数也明显升高（52．6％，X2=5．14，P<0．05 for CCD group and 50．8％，X2=4．32，P<0．01 for MM group）。与CCD组和MM组相比，AS组DRG对低渗溶液的反应明显降低（Tukey Test,bothP<0．05），产生反应的DRG细胞比例数也明显降低（29．1％，X2=8．65，P<0．01 vs。CCD group；X2=7．59，P<0．01 vs．MM group）。与假手术组相比，佛波醇引起的CCD组和MM组钙浓度的峰值明显增加（Tukey Test，both P<0．01），对佛波醇产生反应的DRG细胞比例数也明显升高（46．1％，X2=4．25，P<0．05 for CCD group and47．6％，X2=4．95，P<0．05 for MM group）。佛波醇引起AS组DR(3内钙峰值明显低于CCD组和MM组（Tukey Test，both P<0．05），AS组起反应的DRG细胞比例数也明显低于CCD组和MM组（26．3％，X2=7．31，P<0．01 vs．CCD group；X2=8．22，P<0．01 vs．MM group）。结论1．CCD可以上调TRPV4的基因、蛋白表达，敏化通道的功能。2．TRPV4参与介导CCD导致的机械性异常疼痛。背景背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）是机体初级感觉传入神经元胞体的聚集处，位于椎间孔内，当椎间盘突出和椎管狭窄等导致椎间孔狭窄时，易于受到压迫。持续压迫DRG（chronic compression of the DRG）可产生损伤侧的异常疼痛，并伴有神经元兴奋性的升高，表现为自发性放电增加和电流阂值降低。但是这种异常疼痛的机制还不清楚。有研究者使用基因组学和蛋白质组学方法，对病理性神经痛模型的DRG进行了扫查，发现多种与神经元死亡和再生有关的基因和蛋白的表达量在损伤前后产生了变化，包括细胞骨架蛋白，神经递质代谢酶，炎性因子，合成／成熟相关蛋白和髓鞘形成相关蛋白等。这些研究使我们对外周神经损伤后神经退化和微环境改变的机制有了深入的了解。由于不同病理模型的行为学和病理变化不同，其基因和蛋白质的变化也不同。所以研究不同病理状态下的蛋白质的变化，可以帮助我们了解神经病理状态的分子生物学机制。CCD模型是一种较特别的外周神经损伤模型，其损伤和炎症反应均局限在神经节内。插入钢棒不仅导致机械压迫、DRG缺血、水肿，而且从循环系统、神经元和非神经元释放出的多种炎症因子，使病理环境变得更加复杂。蛋白质是一切生命活动的基础，蛋白质的结构和功能最终直接影响生命活动的变化。使用蛋白质组学方法从整体角度、高通量分析CCD后DRG蛋白质表达的变化，可以从整体上了解病理过程的发生机制和机体相应的自身保护机制。目的使用蛋白质组学方法筛查大鼠DRG持续受压后差异表达的蛋白质，特别是筛查与神经病理性疼痛和组织损伤相关的蛋白。方法1 CCD模型的建立78只Wister大鼠随机分为正常组和CCD组，每组均为39只。CCD模型的建立方法同论文第三部分。28天后处死大鼠，取出DRG。2行为学测量测量大鼠运动功能，机械痛阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和热辐射刺激缩爪反应潜伏期（thermal withdrawl latency）。MWT的测量方法同论文第三部分。热辐射刺激缩爪反应潜伏期使用BME—410A型热痛刺激仪，将热痛刺激仪放在有机玻璃板下方，使光源焦距照射动物后肢足底掌心，电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的潜伏期作为热痛觉观测指标。3双向电泳和图像分析从正常组和CCD组各20只大鼠的L4和L5 DRGs中提取蛋白，Bradford．法定量。双向电泳分离蛋白，银染显色，使用软件进行分析，找出差异表达蛋白。正常组和CCD组之间，斑点体积变化超过3倍的蛋白，为差异表达蛋白。4蛋白的生物质谱分析鉴定将选定的蛋白点切下，胰酶消化后，使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析得到其肽指纹图谱，选取NCBInr和SwissPmt数据库进行在线检索。5 Western blotting使用Western blotting方法验证部分差异表达蛋白质，如膜联蛋白A2，p11，PKCe，GAPDH，热休克蛋白70的变化，方法同论文第二部分。6 Real-time RT-PCR使用实时定量PCR方法检测膜联蛋白A2和PKCe基因表达的变化，方法同论文第二部分。结果1．行为学测定CCD明显降低机械痛阈和热辐射刺激缩爪反应潜伏期（both P<0．05）。从第二天开始，机械痛阈下降，到第四天达到最低值，然后逐渐恢复，但直到术后28天，CCD组大鼠的机械痛阈仍明显低于正常对照大鼠（all P<0．05，SNK）。热辐射刺激缩爪反应潜伏期的变化趋势与机械痛阈相似（all P<0．05，SNK）。所有大鼠的运动功能均正常。2．差异表达蛋白质的鉴定对照组和CCD组分别得到454±4（n=3）和423±+4（n=3）个蛋白质点。98个蛋白点的表达存在明显差异，质谱分析成功鉴定出15种蛋白，其中8种蛋白的表达在CCD组下调，7种蛋白表达上调（其中1种蛋白只存在于CCD组）。3．Western blotting验证Westem blotting分析显示膜联蛋白A2，p1 l，PKCe，GAPDH，热休克蛋白70的表达在CCD组均升高，与质谱分析的结果相符。对照组和CCD组p．actin的表达量无明显变化（t=-0．139，P=0．896），因此适合作为内参。4．CCD对基因表达的影响CCD可以明显增加AnnexinA2和PKCε的基因表达，分别增加到对照组的4．55和3．65倍（bothP<0．05）。结论我们使用差异蛋白质组学的方法，分析了CCD对DRG蛋白质表达的影响，鉴定出15种差异表达的蛋白。其中膜联蛋白A2、p11和PKCe蛋白表达的上调，可能参与了神经性疼痛的发生过程。GAPDH的上调或许参与神经元凋亡，HSP70的表达上调或许和神经保护有关。

论文目录

• 第一部分:大鼠背根神经节机械敏感性离子通道电生理性质的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 试验材料
• 试验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第二部分:持续机械刺激对离体模型大鼠背根神经节TRPV4离子通道的影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 试验材料
• 试验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第三部分:TRPV4在介导背根神经节持续受压后机械性异常疼痛中的作用
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 试验材料
• 试验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第四部分:蛋白质组学分析持续机械压迫对大鼠背根神经节蛋白质表达的影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 试验材料
• 试验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章
• 英文论文
• 学位论文评阅及答辩情况表