猪流感病毒感染A549细胞的亚细胞蛋白组分析

论文摘要

猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）隶属于分节段的单股负链RNA病毒正黏病毒科,除能感染猪体外,还具有感染人类的跨种间传播能力。病毒基因组为分节段的8条单股负链RNA,编码PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、 M2、NS1及NEP（NS2）等10种以上蛋白。目前关于流感病毒跨种间感染的机制研究较少。本研究以SIV感染人肺上皮细胞A549为模型,应用亚细胞蛋白组学方法对SIV感染细胞的蛋白表达变化进行了探索。1、SIV编码蛋白的亚细胞定位采用纯化病毒、Ni2+亲和纯化的原核表达蛋白NP、NS1、M1为免疫原,免疫BALB/c小鼠、新西兰大白兔,分别获得了NP蛋白单克隆抗体分泌细胞3株、M1蛋白单克隆抗体分泌细胞6株、NS1蛋白单克隆抗体分泌细胞6株及兔抗NP、NS1、M1蛋白多克隆抗体。采用荧光双标法,以制备的抗体为工具,分析了H3N2、H1N1SIV及A/PR8/34/H1N1（PR8）感染A549细胞24小时后的病毒蛋白NP、NS1和M1的亚细胞定位及病毒蛋白之间的定位关系。结果显示,H3N2、H1N1SIV（?）口PR8的NP蛋白主要集中分布于感染细胞的核内,但胞质中也有分布。SIV的M1蛋白在感染细胞的胞核、胞质均有表达,但PR8的Ml蛋白仅呈点状分布于细胞核内。SIV的NS1蛋白主要集中分布于感染细胞的核内,PR8的NS1蛋白呈点状分布于细胞核和细胞质。共定位分析显示,仅在H3N2、H1N1SIV感染细胞的核内发现NS1与NP的共定位关系。这些数据说明,两个不同亚型SIV的NP蛋白与PR8的NP蛋白亚细胞分布相同,但Ml和NS1蛋白的亚细胞分布存在差异。2、SIV感染细胞的胞质/胞核亚细胞蛋白质组分析以人肺上皮细胞A549感染猪流感病毒H3N2为感染模型,采用2-DE结合MS研究方法分析细胞感染后24小时的细胞质、细胞核亚细胞蛋白质组表达变化动态。MALDI-TOF/TOF质谱分析结果表明,胞质、胞核组分共有56个差异蛋白点（对应43种蛋白）被鉴定成功（蛋白分数大于67,p<0.05）。其中细胞质组分中对应19个上调蛋白点和15个下调蛋白点,细胞核组分中包含14个上调点和8个下调点。差异蛋白的生物功能学分析表明,SIV感染主要涉及到细胞死亡、压力应答、脂类代谢、信号转导及RAN转录和修饰方面。蛋白相互作用网络（IPA）分析表明,H3N2SIV感染主要激活NF-κB-IFN通路。同时通过对比H1N1SIV感染,利用免疫印迹（WB）和免疫荧光（IFA）验证了差异蛋白的变化规律,发现细胞蛋白WARS、IFI35、HSPB1、NMI、GNB1、GNB2等在病毒感染后有表达上调及入核的表现。免疫共沉淀分析显示NS1与hnRNP C2存在相互作用关系。siRNA干扰和瞬时过表达分析显示,与SIV H1N1感染细胞相比,WARS蛋白对SIV H3N2的M1、NP蛋白的合成量及病毒载量有明显影响。3、SIV感染细胞的线粒体蛋白组学分析线粒体作为真核生物细胞内最重要的一种亚细胞器,参与了细胞凋亡、能量代谢、应激反应及免疫应答等许多方面。为了分析H3N2亚型猪流感病毒感染A549细胞后线粒体的应答反应,本研究采用2-DE结合MS鉴定方法,分析了SIV H3N2感染A549细胞后24小时的线粒体蛋白组变化。2-DE凝胶的比较分析表明,感染前后线粒体蛋白共有29个蛋白点发生了差异表达,包括上调蛋白点16个,下调蛋白点13个。MALDI-TOF/TOF质谱成功鉴定26个差异蛋白点（蛋白分数大于67,p≤0.05）,对应12种上调蛋白,11种下调蛋白。差异蛋白的生物学功能分析表明,H3N2病毒感染涉及细胞形态、免疫应答及信号转导蛋白的表达变化。差异表达蛋白的network网络和pathway通路分析结果表明,氧化磷酸化通路（Oxidative phosphorylation）、整联蛋白信号通路（1ntegrin signaling）是线粒体应答细胞感染的主要通路。实时荧光定量RT-PCR对SIV H3N2感染后24h的16个细胞差异表达蛋白的转录本分析表明,RNA加工及蛋白表达类基因、细胞死亡相关基因均是上调表现；细胞间信号转导类基因以上调为主;细胞蛋白组装类基因以下调为主；能量合成类基因的变化不大。综合以上信息,发现干扰素诱导表达蛋白Mx1,热休克蛋白等在三组分中均有明显上调,WARS在胞质、胞核组分中上调,hnRNP H家族蛋白在细胞核中上调,而在线粒体中下调。因此,本研究揭示的病毒感染后亚细胞蛋白质组信息为进一步开展SIV跨种间感染的分子致病机制奠定了基础。

论文目录

• 论文创新点
• 目录
• 摘要
• Abstract
• 研究意义
• 技术路线
• 第一部分 文献综述
• 第一章 流感病毒生物学特性
• 1.1 流感病毒的成分构成与基因组
• 1.2 流感病毒的蛋白结构与功能
• 1.2.1 聚合酶蛋白PB2
• 1.2.2 聚合酶蛋白PB1
• 1.2.3 聚合酶蛋白PA
• 1.2.4 血凝素蛋白HA
• 1.2.5 核蛋白NP
• 1.2.6 神经氨酸酶蛋白NA
• 1.2.7 基质蛋白M1
• 1.2.8 离子通道蛋白M2
• 1.2.9 非结构蛋白NS1
• 1.2.10 核输出蛋白NEP
• 1.2.11 新鉴定蛋白PB1-F2与N40
• 1.3 流感病毒的复制周期
• 1.3.1 流感病毒与宿主细胞的结合与融合
• 1.3.2 病毒RNA的转录与复制
• 1.3.3 病毒蛋白的翻译和表达
• 1.3.4 病毒组分的装配与出芽
• 1.4 流感病毒跨种间传播的分子机制
• 1.4.1 病毒蛋白特定氨基酸突变对其与受体结合特异性的影响
• 1.4.2 流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA的功能平衡影响病毒结合特异性
• 1.4.3 流感病毒跨种间传播途径与机理
• 1.5 流感病毒诱导宿主通路及干扰素诱导效应因子
• 1.5.1 NF-κB-IFN信号通路
• 1.5.2 干扰素诱导效应因子
• 第二章 亚细胞蛋白质组学及其在病毒研究中的应用进展
• 2.1 细胞核蛋白质组学
• 2.2 核仁蛋白质组学
• 2.3 线粒体蛋白质组学
• 2.4 细胞骨架蛋白质组学
• 2.5 膜蛋白质组学
• 2.6 其它细胞器蛋白质组学
• 2.6.1 高尔基体蛋白质组学
• 2.6.2 内质网蛋白质组学
• 2.6.3 过氧化物酶体和溶酶体蛋白质组学
• 第二部分 研究内容
• 第一章 流感病毒NP、M1、NS1蛋白表达及抗体制备
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒株、菌株、细胞、鸡胚和动物
• 1.1.2 载体、抗体、酶和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 病毒扩繁
• 1.2.2 病毒纯化
• 1.2.3 病毒NP,M1,NS1基因的克隆
• 1.2.3.1 引物设计
• 1.2.3.2 病毒总RNA抽提
• 1.2.3.3 反转录
• 1.2.3.4 PCR目的基因全长扩增
• 1.2.3.5 PCR产物纯化回收
• 1.2.4 TA连接反应
• 1.2.5 感受态细胞制备
• 1.2.6 转化
• 1.2.7 碱裂解法抽提重组质粒
• 1.2.8 重组质粒PCR鉴定和测序
• 1.2.9 SIVH3N2-NP,M1,NS1基因的原核表达和蛋白纯化
• 1.2.9.1 NP、M1和NS1原核表达载体构建
• 1.2.9.2 重组NP、M1和NS1蛋白的诱导表达
• 1.2.9.3 重组NP、M1和NS1蛋白的纯化
• 1.2.10 抗SIVH3N2 NP、M1和NS1蛋白单克隆抗体制备
• 1.2.10.1 小鼠免疫
• 1.2.10.2 细胞融合及选择性培养
• 1.2.10.3 融合细胞的筛选、有限稀释及单克隆化
• 1.2.10.4 单抗腹水制备、亚类（型）及效价测定
• 1.2.10.5 单抗腹水特异性鉴定
• 1.2.10.5.1 Western blot
• 1.2.10.5.2 间接免疫荧光（IFA）
• 1.2.11 SIV H3N2病毒NP、M1、NS1真核表达分析
• 1.2.11.1 NP、M1、NS1真核表达载体构建
• 1.2.11.2 真核表达质粒的超纯
• 1.2.11.3 超纯质粒转染、目的基因真核表达的IFA检测
• 1.2.12 兔抗SIV H3N2病毒NP、M1和NS1蛋白多克隆抗体制备
• 1.2.13 双免疫荧光染色
• 2 结果
• 2.1 SIV H3N2病毒基因NP、M1、NS1的RT-PCR
• 2.2 SIV H3N2 NP、M1、NS1基因原核表达载体的构建
• 2.3 SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白在E.coli BL21（DE3）中诱导表达
• 2.4 SIV H3N2 NP、M1、NS1原核重组表达蛋白的纯化
• 2.5 SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白单克隆抗体制备
• 2.6 SIV H3N2病毒蛋白单克隆抗体的反应特异性鉴定
• 2.7 单克隆抗体亚类鉴定及腹水效价
• 2.8 SIV H3N2 NP、M1、NS1真核表达载体构建及转染
• 2.9 SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白兔多克隆抗体制备
• 2.10 NP,M1,NS1蛋白在不同亚型流感病毒感染细胞内的定位关系
• 2.10.1 NS1与NP的定位关系
• 2.10.2 NP与M1的定位关系
• 2.10.3 M1与NS1的定位关系
• 3 讨论
• 第二章 SIV感染A549的质、核亚细胞差异蛋白组分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒株与细胞
• 1.1.2 试剂与抗体
• 1.1.3 仪器与软件
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 样品制备
• 1.2.2 亚细胞组分（胞质、胞核）的二维凝胶电泳
• 1.2.2.1 一向等电聚焦
• 1.2.2.2 胶条平衡
• 1.2.2.3 二向SDS-PAGE分离
• 1.2.2.4 银染
• 1.2.3 图像扫描及软件分析
• 1.2.4 挖点及胰蛋白酶解
• 1.2.5 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定及数据库检索
• 1.2.6 差异蛋白的功能分类
• 1.2.7 构建差异蛋白互作网络分析
• 1.2.8 Western blot验证
• 1.2.9 免疫荧光（IFA）验证
• 1.2.10 免疫共沉淀分析
• 1.2.11 WARS蛋白的siRNA干扰
• 1.2.12 WARS蛋白的过表达
• 1.2.13 绝对定量PCR检测病毒拷贝数
• 1.2.14 差异表达蛋白IF135的移位鉴定
• 2 结果
• 2.1 样品制备
• 2.2 SIV H3N2感染A549的胞质、胞核二维电泳分析
• 2.2.1 二维凝胶电泳
• 2.2.2 二维电泳图谱分析
• 2.3 差异表达蛋白的质谱鉴定
• 2.4 差异表达蛋白的功能分类
• 2.5 差异表达蛋白的IPA分析
• 2.6 差异表达蛋白的Western blot验证
• 2.7 差异表达蛋白的免疫荧光验证
• 2.8 HA-NS1与Flag-hnRNP C2的免疫共沉淀分析
• 2.9 差异表达蛋白WARS的siRNA干扰分析
• 2.10 差异表达蛋白WARS的过表达分析
• 2.11 差异表达蛋白WARS对病毒载量的影响分析
• 2.12 差异表达蛋白IF135的移位鉴定
• 3 讨论
• 3.1 病毒感染与RNA加工、凋亡相关蛋白
• 3.2 病毒感染与NF-KB-IFN通路及干扰素诱导效应蛋白
• 3.3 病毒感染与脂类代谢相关蛋白
• 第三章 SIV感染A549的线粒体差异蛋白组分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒株与细胞
• 1.1.2 试剂与抗体
• 1.1.3 仪器与软件
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 样品制备
• 1.2.2 线粒体组分的电镜观察
• 1.2.3 线粒体组分的二维凝胶电泳
• 1.2.3.1 一向等电聚焦
• 1.2.3.2 胶条平衡
• 1.2.3.3 二向SDS-PAGE分离
• 1.2.3.4 银染
• 1.2.4 图像扫描及软件分析
• 1.2.5 挖点及胰蛋白酶解
• 1.2.6 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定及数据库检索
• 1.2.7 差异蛋白的功能分类
• 1.2.8 实时RT-PCR
• 1.2.8.1 引物设计
• 1.2.8.2 细胞总RNA抽提
• 1.2.8.3 反转录RT
• 1.2.8.4 实时定量PCR
• 1.2.9 差异蛋白Network网络及pathway通路分析
• 1.2.10 差异表达蛋白APOL2的移位鉴定
• 2 结果
• 2.1 样品制备及线粒体组分纯度鉴定
• 2.2 SIV H3N2感染A549的线粒体二维电泳分析
• 2.2.1 二维凝胶电泳
• 2.2.2 二维电泳图谱分析
• 2.3 差异表达蛋白的质谱鉴定
• 2.4 差异表达蛋白的功能分类
• 2.5 差异表达蛋白的转录本分析
• 2.6 差异表达蛋白的IPA分析
• 2.7 差异表达蛋白APOL2的移位鉴定
• 3 讨论
• 3.1 流感病毒感染引起细胞死亡相关蛋白表达变化
• 3.2 蛋白组装与转运相关蛋白
• 3.3 整合蛋白与细胞间信号传递
• 3.4 RNA加工与翻译
• 3.5 能量代谢
• 全文总结
• 参考文献
• 附录A 全文缩略语
• 附录B 常用缓冲液及配方
• 附录C 博士期间录用或待发表的学术论文
• 致谢