水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

论文摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）引起,是世界水稻生产中的两大重要病害,造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害,是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因,研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因,在依赖于生长素的发育中发挥功能,同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素,而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质—伸展蛋白（α-和β-expansins）,破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用,以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xα21或Xα26抗病水稻品种中,病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA—氨基酸的合成抑制生长素的作用,从而阻止细胞壁的松弛,增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性,同时也延缓了植株的生长和发育,至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径,同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常;通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现,GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常,这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异,但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育,这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达,并随着花的发育表达强弱也不断变化,而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术,筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达,证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达,而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育;检测雌蕊没有发现和野生型有显著差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性,说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达,显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达,OsDR8的功能在信号路径的上游。另外,维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。通过筛选水稻T-DNA插入突变体库,发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低,而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高,在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A和sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37,转基因植株类病斑表型消失,说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

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Abstract

1 前言

1.1 植物免疫系统

1.1.1 植物先天免疫系统

1.1.1.1 病原相关分子模式引发的先天免疫反应

1.1.1.1.1 病原物的病原相关分子模式

1.1.1.1.2 植物的模式识别受体

1.1.1.1.3 病原相关分子模式引发的先天免疫反应的信号途径

1.1.1.1.4 病原物对植物的先天免疫系统的抑制作用

1.1.1.2 R基因介导的抗病反应

1.1.1.3 非寄主抗性

1.1.2 植物后天免疫系统

1.1.2.1 系统获得性抗性

1.1.2.2 诱导系统抗性

1.1.3 植物激素在免疫系统中的作用

1.1.3.1 脱落酸在植物免疫系统中的作用

1.1.3.2 生长素在植物免疫系统中的作用

1.1.3.2 其它植物激素在植物免疫系统中的作用

1.2 植物类病斑突变体研究进展

1.2.1 类病斑突变体的防御信号途径

1.2.1.1 SA信号途径在类病斑形成中的作用

1.2.1.2 JA和ET信号途径在类病斑形成中的作用

1.2.1.3 R基因介导的抗性在类病斑形成中的作用

1.2.2 类病斑形成的机制

1.2.3 水稻中的类病斑突变体

1.3 植物抗病相关基因的克隆策略

1.3.1 T-DNA标签技术

1.3.2 转座子标签技术

1.3.3 建立在RNA水平上的差别表达基因克隆方法

1.4 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 水稻材料与来源

2.2 菌株

2.3 基因结构分析

2.3.1 GH3-8基因结构分析

2.3.2 OsDR9基因的分离和结构分析

2.4 载体构建及农杆菌介导的遗传转化

2.4.1 GH3-8基因表达载体构建

2.4.2 GH3-8蛋白的亚细胞定位载体构建

2.4.3 EXPA1、EXPA5和EXPA10超量表达载体构建

2.4.4 突变体02Z15AM37互补载体的构建

2.4.5 农杆菌介导的遗传转化

2.5 白叶枯病菌接种、病情和细菌生长分析

2.6 稻瘟病和胡麻叶斑病接种与调查

2.7 外源信号分子与非生物胁迫处理

2.7.1 水稻材料准备

2.7.2 胁迫处理

2.8 核酸操作及分子杂交分析

2.8.1 DNA抽提与Southern杂交分析

2.8.2 RNA抽提与Northern杂交分析

2.9 RT-PCR和定量RT-PCR分析

2.10 GUS染色

2.11 基因枪介导的瞬时表达分析即亚细胞定位

2.12 酵母单杂交

2.13 GH3-8酶活分析

2.14 内源水杨酸、茉莉酸、吲哚乙酸和吲哚乙酸结合物测定

2.15 激光扫描共聚焦显微镜观察GH3-8超量表达植株胚囊结构

2.16 台盼蓝染色和紫外荧光检测细胞程序性死亡

2.17 水稻叶片中的活性氧类物质检测

3 结果与分析

3.1 GH3-8介导的独立于SA和JA的水稻基础免疫

3.1.1 GH3-8基因结构和序列分析

3.1.2 GH3-8介导水稻对白叶枯病的抗性

3.1.3 GH3-8基因影响水稻植株的发育

3.1.4 GH3-8基因功能冗余

3.1.5 GH3-8蛋白是一个IAA酰胺合成酶,它调节生长素的动态平衡

3.1.6 IAA影响细菌的侵染以及细菌侵染诱导局部IAA的积累

3.1.7 上调GH3-8基因的表达或抗病反应抑制生长素信号

3.1.8 上调GH3-8表达激活的抗病反应不需要激活SA和JA信号

3.1.9 上调GH3-8的表达或抗病反应中伴随着伸展蛋白基因表达被抑制

3.1.10 超量表达伸展蛋白基因增加水稻对白叶枯病菌的敏感性

3.1.11 多种信号分子诱导GH3-8基因的表达

3.1.12 GH3-8蛋白位于细胞质

3.2 生长素信号调节水稻穗的发育

3.2.1 GH3-8基因的表达受生长素反应因子的调控

3.2.2 GH3-8基因影响水稻穗的发育

3.2.3 生长素信号和水稻穗的发育相关

3.3 OsDR8介导的水稻抗病反应

3.3.1 OsDR8通过影响维生素B1的水平介导植物的防御反应

3.3.2 OsDR8影响防御相关基因的表达

3.4 类病斑基因OsDR9的分离和功能鉴定

3.4.1 筛选和鉴定类病斑突变体02Z15AM37

3.4.2 类病斑突变体侧翼序列的分离和T-DNA插入的共分离分析

3.4.3 突变体02Z15AM37对水稻病原真菌的抗性增强

3.4.4 OsDR9基因结构分析

3.4.5 突变体02Z15AM37表达水平共分离检测

3.4.6 突变体02Z15AM37白发的细胞死亡具有凋亡特征

3.4.7 突变体02Z15AM37积累酚类化合物

3.4.8 突变体02Z15AM37激活防御反应基因的表达

3.4.9 突变体02Z15AM37提高了活性氧物质的水平

3.4.10 OsDR9基因组织特异性表达

3.4.11 突变体02Z15AM37植株提高了内源水杨酸和茉莉酸含量

3.4.12 突变体02Z15AM37植株积累植保素

3.4.13 OsDR9基因的功能互补验证

4 讨论

4.1 GH3-8以及生长素介导的水稻基础免疫机制

4.1.1 白叶枯菌诱导水稻内源合成IAA

4.1.2 GH3-8介导的基础抗性不需激活依赖于SA和JA的抗病信号传导途径

4.1.3 GH3-8在植物发育和抗病反应中的双重角色

4.2 OsDR8通过调节维生素B1的合成影响水稻的抗病反应

4.3 水稻类病斑形成机制及其利用

4.3.1 水稻类病斑突变体调控多样复杂的信号路径

4.3.2 OsDR9基因在抗病反应和类病斑的形成中的作用

4.3.3 ROS在水稻抗病和细胞生存中的双重作用

4.3.4 类病斑突变体的实践应用价值

5 参考文献

致谢

附录

附录1:部分实验的详细操作程序

Protocol 1:小样法抽提植物DNA

Protocol 2:Reverse Transcription for RT-PCR and Real-time RT-PCR

Protocol 3:Quantitation of free SA and SA Conjugates

Protocol 4:Quantitation of IAA,IAA-Asp,IAA-Ala and JA

附录2:作者简介和在读期间发表论文目录

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