论文摘要
紫茎泽兰（Ageratina adenophora （Spreng.） R.M.King & H.Rob., Syn:Eupatorium adenophorum Spreng.）早年传入东南亚热带地区,大约于二十世纪40年代开始入侵中国西南的热带及南亚热带地区,后逐渐扩散蔓延为外来恶性杂草。南京农业大学杂草研究室前期研究表明,它在向北入侵过程中逐渐产生耐寒种群的分化,这种分化是与低温响应有关的ICE-CBF转录途径基因的适应性分化有关。因此,对低温关键转录因子CBF1（C-repeat binding factor）、上游调节因子ICE1（inducer of CBF expression 1）及下游冷诱导基因COR（cold responsive gene）进行克隆,研究发现,4℃低温处理下,这些基因在耐寒种群（HGG）中的表达量高于冷敏感种群（BSG）,但是,导致这些基因表达量差异的原因目前尚不清楚。IC31（inducer of CBF expression 1）基因作为CBF基因家族表达的转录激活因子,低温时特定地结合到CBF基因的启动子区域,诱导CBF基因的表达。CBF基因表达产物结合到其下游COR基因启动子的CRT/DRE区域上,诱导下游基因的表达,提高植物的抗寒能力。但是,ICE1是如何在转录水平被调节而作用于耐寒性分化也不清楚。本文通过对紫茎泽兰在中国耐寒性分化的生物地理学规律的研究以及调控耐寒性的ICE-C1BF转录途径主要成员AaCBF2、AaCBF3基因的克隆及表达量分析、AaCBF3 和AaICE1启动子扩增以及这些基因序列及启动子区域甲基化位点比较,解释AaICE1、AaCBF和AaCOR基因差异表达的原因,阐明紫茎泽兰种群进行耐寒性分化的分子机理。1.紫茎泽兰种群耐寒性分化的生物地理分布规律的研究在本实验室前人评价紫茎泽兰16个种群的基础上,进一步增加种群18个,利用冻害症状显示的冷害指数,以及使用Imaging-PAM和Handy-PEA仪测定的荧光参数比较34个紫茎泽兰种群的耐寒性,并与采样点的纬度、极端最低温度和最冷月平均温度进行了相关性分析,分析了紫茎泽兰耐寒性地理分布的规律。研究结果显示：紫茎泽兰种群的耐寒能力发生了显著的分化,广西百色和云南曲靖等7个种群为冷敏感种群,云南大理、云南景洪及云南玉溪等19个种群为中度耐寒种群,而贵州黄果树、四川自贡及四川雅安等8个种群为耐寒种群；紫茎泽兰种群耐寒性与采样点的纬度呈显著正相关性（p<0.001）,与极端最低温度（p<0.01）和最冷月平均温（p<0.01）呈显著负相关；耐寒性较强的种群主要集中在采样点的北部,而冷敏感种群和中度耐寒种群主要集中在南部和中部,说明紫茎泽兰在入侵中国的过程中产生了耐寒性分化,并有逐年向北入侵的趋势。2.紫茎泽兰种群耐寒性分化的ICE-CBFs转录途径分化的研究AaCBF2、AaCBF3基因cDNA序列的克隆和结构分析：运用RACE的方法,以紫茎泽兰黄果树（HGG）种群的叶片为材料,分别克隆得到全长为908bp和923bp的AaCBF3和AaCBF2基因的cDNA序列,分别含有720bp和654bp的完整阅读框,编码240aa和218aa,扩增AaCBF2和AaCBF3基因的DNA序列发现均不含内含子。通过生物信息学分析,AaCBF3和AaCBF2基因属于典型的AP2家族,可以激活COR基因的表达。紫茎泽兰耐寒种群贵州黄果树（HGG）与冷敏感种群广西百色（BSG）以及两个中间种群云南大理（DLY）和云南景洪（JHY） AaCBF3和AaCBF2基因序列,未发现差异位点。紫茎泽兰不同耐寒种君AaCBF2、AaCBF3、AaCOR基因表达情况比较：荧光定量PCR比较4℃处理条件下,紫茎泽兰不同耐寒种群AaCBF3、AaCBF2和AaCOR基因表达情况,结果表明AaCBF3、AaCBF2和AaCOR基因常温下均不表达,4℃处理4h时AaCBF3基因表达量达到最大值,耐寒的HGG种群表达量最高,中度耐寒种群次之,冷敏感种群BSG表达量最低；AaCBF2基因在经冷处理时表达迅速,冷敏感BSG种群在4℃下处理1h时基因表达量达到最大值,表达量显著较高；抗冷的HGG种群在4℃下处理1h时基因表达量达到最大值,但表达量较百色种群明显要低,中度耐寒的大理和景洪种群0.5 h时基因表达量达到最大值,在1h时表达量略有下降,2-8h时维持在较高水平,但表达量低于百色种群。AaCOR基因作为AaCBF3的下游基因,表达较AaCBF3晚,冷处理12h时达到最大值,HGG种群表达量最高而BSG最低。上述不同耐寒种群的基因表达状况与已报道的ICE-CBF转录途径的这些成分的表达行为相一致,说明AaCBF3、AaCBF2和AaCOR基因表达可能与紫茎泽兰的耐寒性密切相关。3.紫茎泽兰种群ICE-CBFs转录途径分化的分子机制研究通过分析比较紫茎泽兰不同耐寒性种群AaICE1和AaCBF3基因侧翼序列：运用Tail-PCR的方法,对紫茎泽兰不同种群AaICE1和AaCBF3基因的5’端侧翼序列进行扩增,分别获得了长1043bp和977bp的DNA扩增片段。测序发现AaCBF3基因DNA的5’侧翼序列含有1个TATA box （-99～-94bp）、1个G-box （-116～-110bp）、3个MYC识别位点（-271～-266bp,-217～-212bp和-171--166bp）和1个MYB识别位点（-214～-209bp）,AaICE1基因DNA的5’侧翼序列含有1个’TATA box（-108～-103bp）。各种群AaICE1和AaCBF3基因的5’端侧翼序列完全相同。通过分析比较紫茎泽兰不同耐寒性种群AaICE1和AaCBF3基因及侧翼序列甲基化位点：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,比较各种群AaICE1和AaCBF3基因甲基化位点差异,发现不同耐寒性种群紫茎泽兰AaICE1基因区域甲基化程度不同,差异位点集中在前623bp区域内,耐寒性种群、中度耐寒性种群和冷敏感种群中发生甲基化的C个数分别为50个、61-63个和66个。AaICE1基因的甲基化程度与紫茎泽兰种群耐寒性密切相关（p<0.001）,表现为耐寒性强的种群甲基化程度低于中度耐寒性和冷敏感种群,耐寒性越强的种群,AaICE1基因的甲基化程度越低。说明去甲基化导致了ICE-CBF转录途径的分化。综上所述可知：紫茎泽兰的AaICE1基因通过甲基化调控自身的表达量,从而导致了紫茎泽兰耐寒生态适应性的分化。