论文摘要
生长抑素（Somatostatin, SS）是具有多种生物学活性的环肽激素家族,主要分布在内分泌胰腺、消化道,周围神经系统和中枢神经系统中,在颌下腺、甲状腺、肾上腺、肾脏、前列腺、血管壁、胎盘和免疫细胞中也有少量分布。细胞研究表明,生长抑素通过与G蛋白偶联的受体结合发挥其生理学作用,抑制生长激素分泌和释放,抑制内分泌激素和胃肠道外分泌的作用,能作为神经递质或神经调节因子,能调节正常细胞和肿瘤细胞增殖和分化。目前,在斑马鱼中发现存在6种SS基因（SS1-6）,但对SS在胚胎中的功能知之甚少。在前期研究中,我们发现SS3在斑马鱼胰腺组织中持续表达；双敲降SS3和SS4,胰高血糖素和胰岛素mRNA显著减少。为验证SS3在斑马鱼早期胚胎发育中对胰岛素的调控表达,我们选用斑马鱼的胚胎为模型,利用体外合成SS3 mRNA对敲降胚胎进行营救实验,研究结果对了解SS3在斑马鱼胚胎发育过程中的功能具有重要意义。首先,为验证MO的有效性,构建了包含SS3 5’端MOs靶序列带报告基因EGFP的pCS2+SS3 MO EGFP重组质粒,通过在斑马鱼胚胎中共注射SS3 MOs和pCS2+ SS3 MO EGFP重组质粒,结果表明基于SS3 mRNA所设计的SS3靶向反义寡核苷酸MOs在活体胚胎细胞中可以高效和特异性的敲降SS3基因表达,具有很强的靶向序列特异性。其次,基于密码子简并性,通过亚克隆引入突变碱基,但保持编码氨基酸不变,构建了抗-SS3 MO带报告基因的融合质粒,共注射SS3 MOs和pCS2+SS3 EGFP重组质粒,结果表明质粒在胚胎细胞中成功表达报告基因,并证明了该突变序列具有MO抗性。利用“功能获得”的方法用抗-SS3 MO的pCS2+SS3 kzm重组质粒体外合成SS3 mRNA并与MOs共注射进行营救实验,结果显示共注射SS3 MOs+SS4 MOs+抗-SS3 MO mRNA的斑马鱼胚胎表型和对照组无显著差异,表明体外合成的SS3 mRNA可以营救SS3 MOs和SS4 MOs表型缺陷。体外转录的抗-SS3 MO mRNA在体内所合成的蛋白质能够替代体内天然SS3的大部分功能。为了验证马鱼胚胎SS3对胰岛素基因表达调节的特异性,我们用地高辛标记的核酸探针原位杂交检测胰岛素mRNA的表达分析营救效果,结果表明：双敲降SS3和SS4后,胰岛素mRNA显著减少,注射SS3mRNA营救双敲降胚胎使胰腺细胞胰岛素mRNA表达恢复或增加。推测SS3在斑马鱼胚胎发育时期可能以旁分泌的形式通过一定的途径参与斑马鱼胚胎胰腺细胞胰岛素基因的转录调控,SS3能够替代SS4对胰岛素的调节作用。推测胚胎期SS3对胰岛素转录的调控是SSs对胰岛素合成和分泌负调控和胰岛素通过胰岛素受体信号自分泌调控以及胚胎发育过程需要维持胞外胰岛素水平稳态偶联反馈调节的结果。此外,还发现SS3和SS4双敲降斑马鱼胚胎还表现出一些表型特征：卵黄延伸缺陷,脑室扩张等特征,营救后这些表型缺陷恢复,表明SS3很可能在胚胎发育时期作为系统性内分泌信号参与调节胚胎早期发育生长过程。