小麦抗条锈基因Yr15分子标记的鉴定

论文摘要

我国小麦条锈病危害普遍而严重,由于条锈病菌的高度变异性,导致很难对小麦条锈病进行持续有效的控制。在抗病育种中应用分子标记辅助选择有利于实现抗条锈病多基因积累,从而加速持久抗病品种的培育进程。在1910 年Yr15 基因发现于以色列北部野生小麦Triticum dicoccoide s 中,大量研究证明该基因对当前流行小种抗性良好。因而,以小麦抗条锈病Yr15 基因为研究对象,对于抗条锈基因的分子标记辅助选择、图谱克隆和基于抗病基因同源序列克隆抗条锈病基因有重要价值。RGA 标记技术是利用抗病基因具有保守结构域的特性,通过人工合成引物对基因组DNA 进行定点扩增,在全基因组水平上检测DNA 变异。在本实验中,首先以小麦抗条锈病基因Yr15 的近等基因系Yr15/6×Avocet S 和感病亲本Avocet S 为材料进行RGA 分析。扩增产物用4%变性聚丙烯酰氨分离,银染显色。可以检测到30～70 条带,是琼脂糖凝胶电泳检测的5 倍以上。本研究根据已克隆R 基因普遍具有的NBS 结构域的P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a 和LRR 区设计49 条RGA 引物,组成442 对引物组合,发现2 条稳定的多态性DNA片段。而且,由于PAGE 能够稳定检出低拷贝的扩增片段,大大地改善了RGA 分析的重复性。其次,对2 条多态性DNA 片段与Yr15 基因的遗传连锁性进行初步检测,确定了由引物XaILR-F 和PtoFen-S 扩增的Yr15-R1,以及由引物XaILR-R 和Pto-kin2IN 扩增的Yr15-R2 两条多态性片段都与Yr15 基因有连锁性。经用214 株Avocet S 和Yr15/6×Avocet S 杂交制备的F2 代分离群体进行遗传连锁性检测,特异扩增产物Yr15-R1 与Yr15 基因完全连锁。用Mapmaker 3.0b 软件分析确定Yr15-R2 与抗条锈基因Yr15 紧密连锁,遗传距离2.0cM。最后,对这两条连锁的多态性片段Yr15-R1 和Yr15-R2 进行克隆、测序,并进一步对测得的序列进行了比较分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 我国小麦条锈病发生概况和防治中的问题
• 1.2 植物抗病基因研究进展
• 1.2.1 R 基因的结构
• 1.2.2 R 基因的分类
• 1.2.3 植物抗病基因同源序列研究现状及其应用
• 1.3 小麦抗条锈病基因的分子标记及定位
• 1.3.1 小麦抗条锈病基因的分子标记
• 1.3.2 小麦抗条锈病基因的定位
• 1.4 本项研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 用于RGA 分析的小麦材料
• 2.1.2 供试小麦条锈菌菌种
• 2.1.3 小麦材料的抗病性鉴定
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.2 DNA 的检测与定量
• 2.2.3 供试材料的PCR 分析
• 2.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 银染
• 2.2.6 DNA 回收和纯化
• 2.2.7 多态性片段连接和转化
• 2.2.8 重组质粒的快速提取
• 2.2.9 重组质粒酶切鉴定
• 2.2.10 序列测定
• 3 结果与分析
• 3.1 RGA 方法标记小麦抗条锈病基因Yr15
• 12代群体DNA 的鉴定'>3.1.1 基因组DNA 的提取与F₁2代群体DNA 的鉴定
• 3.1.2 RGA 引物对供试材料分析
• 3.1.3 遗传连锁性检测
• 3.2 小麦抗条锈病基因Yr15 分子标记序列分析
• 3.2.1 多态性片段 Yr15-R1、AS-UP、Yr15-R2 的回收
• 3.2.2 多态性片段 Yr15-R1、AS-UP、Yr15-R2 的克隆
• 3.2.3 克隆片段的序列测定
• 3.2.4 克隆片段的序列比较
• 4 讨论
• 4.1 影响变性 PAGE 分离 RGA-PCR 产物检测效率的因素
• 4.2 用抗病基因同源序列方法在小麦中寻找抗性相关基因
• 4.3 RGA 方法存在的问题
• 5 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢