紫外线UV-B诱导酵母细胞凋亡及调节机制作用

论文摘要

近年来,人们已经成功建立起酵母细胞的凋亡调节机制。尽管紫外线UV-B已经被广泛运用为研究人类细胞和植物细胞的凋亡的“刺激物”,但是运用于酵母细胞的研究甚少。为了研究酵母细胞在紫外线UV-B压力下的应对机制,将活化后的酵母细胞暴露在24 J／cm2、312 nm紫外灯下伤害培养大约96h,进行观察研究。本文首先通过观察紫外线对酵母细胞的致死率、酵母细胞形态,核酸含量和总蛋白等方面的影响,确证了其对酵母细胞产生的严重的而不可逆的伤害。其中,照射96h后的细胞存活率比未照射细胞低16%（P<0.05）; SDS-PAGE电泳图中,部分改变的蛋白也为紫外线UV-B诱导的氧化损伤提供了初步的证据。然后采用DAPI染色法和DNA Ladder实验法结合,初步证明了紫外线UV-B诱导产生的酵母细胞凋亡。荧光显微镜下,细胞呈现出典型的凋亡现象,即细胞浓缩、边缘形成新月状、核膜崩溃及细胞溶解形成凝聚的凋亡小体；琼脂糖凝胶电泳图中,可以明显看出DNA断裂现象,且衍生出一些大约200bp的小碎片。其次,实验还观察了调节机制中氧平衡的调节。检测紫外线UV-B照射后酵母细胞内五种抗氧化物质的含量,发现SOD、CAT和GR的含量分别高于未照射的11%,15%和15%；胞内海藻糖和麦角甾醇的含量也稳步增加,最高值分别为114.7 mg／g和15.4 mg/g,而未照射细胞内含量值改变不大。其中,一些酶系抗氧化物质之间还具有较强的关联性,例如SOD和CAT、GR的关联值分别是0.9754和0.9915。这说明SOD等在保持胞内必要的氧化／抗氧化的平衡中发挥了重要的作用,高于其增大胞内氧化损伤的作用,并且还说明氧平衡的调节不能仅仅通过单个酶或某个抗氧化物质。实验最后观察了紫外线UV-B照射后细胞抵抗其他压力的情况,结果显示细胞通过调节获得了较强的再生能力和抗性。将紫外线UV-B照射后活酵母细胞重新进行紫外线UV-B照射,培养12 d照射过细胞的存活率仍有10%（P<0.05）,而未照射细胞已经基本死亡；经过不同程度H2O2和热处理的照射后活酵母细胞,抗性也具有较大幅度的提高。总之,酵母细胞通过细胞凋亡调节机制有效的抵抗了紫外线UV-B带来的压力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 紫外线UV-B辐射的生物学效应
• 1.1.1 紫外线UV-B辐射的物理性质
• 1.1.2 紫外线UV-B辐射对生态系统的影响
• 1.1.3 紫外线UV-B辐射对植物的影响
• 1.1.4 紫外线UV-B辐射对藻类和水生生态系统的影响
• 1.1.5 紫外线UV-B辐射对人类的影响
• 1.1.6 紫外线UV-B辐射对微生物的影响
• 1.2 细胞凋亡
• 1.2.1 细胞凋亡的介绍
• 1.2.2 细胞凋亡机制
• 1.2.3 酵母细胞凋亡
• 1.2.4 紫外线UV-B辐射诱导的细胞凋亡
• 1.3 紫外线UV-B与酵母细胞凋亡
• 1.3.1 紫外线UV-B辐射对酵母细胞的伤害作用
• 1.3.2 酵母细胞对紫外线UV-B辐射的反馈调控
• 1.4 论文的研究背景和内容
• 1.4.1 论文研究背景
• 1.4.2 论文研究内容
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 活性干酵母活化方法
• 2.2.2 紫外线UV-B的照射方法
• 2.2.3 生长曲线测定方法
• 2.2.4 致死率测定方法
• 2.2.5 DNA ladder实验
• 2.2.6 核酸提取试验
• 2.2.7 总蛋白电泳实验
• 2.2.8 DAPI法证明细胞凋亡
• 2.2.9 AnnexinV/PI法证明细胞凋亡
• 2.2.10 活细胞收集
• 2.2.11 紫外线UV-B再照射抗性实验
• 2O₂抗性实验'>2.2.12 H₂O₂抗性实验
• 2.2.13 热冲击（Hit shock）抗性实验
• 2.2.14 五种抗氧化物质检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 紫外线UV-B照射实验
• 3.1.1 紫外线UV-B照射灯的选定
• 3.1.2 生长曲线的测定
• 3.1.3 致死率的测定
• 3.2 紫外线UV-B照射对酵母细胞的伤害作用
• 3.2.1 紫外线UV-B照射对酵母细胞形态的改变
• 3.2.2 紫外线UV-B照射对酵母细胞总DNA的伤害
• 3.2.3 紫外线UV-B照射对酵母细胞核酸含量的影响
• 3.2.4 紫外线UV-B照射对酵母细胞总蛋白的伤害
• 3.3 紫外线UV-B诱导的细胞凋亡
• 3.3.1 DAPI法
• 3.3.2 AnnexinV/PI法
• 3.3.3 小结
• 3.4 酵母细胞对紫外线UV-B的反馈调节
• 3.4.1 紫外线UV-B再照射抗性调节
• 2O₂和热冲击（Hit shock）交叉抗性调节'>3.4.2 H₂O₂和热冲击（Hit shock）交叉抗性调节
• 3.4.3 各种胁迫压力伤害酵母细胞蛋白质
• 3.4.4 五种抗氧化物质含量的调节
• 3.4.5 小结
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢