青海湖可培养嗜盐菌种群分子进化差异分析

论文摘要

目的嗜盐菌（Halophile）是一类能够在高盐极端环境下生存、生长的微生物，多分布于海洋、盐湖、盐场以及腌制品等环境中。嗜盐菌具有特殊的生理结构和代谢机制，对维持生态平衡具有重要意义。青海湖，位于青藏高原东北部，是我国最大的内陆咸水湖，含盐度约为6%，湖中嗜盐菌种类丰富，特殊的生态环境使青海湖嗜盐菌长期生存在高盐、低压、缺氧环境中。目前针对青海湖嗜盐菌嗜盐特性、生理生化特性、种群多样性、分子进化和耐盐机制的研究以及盐单胞菌属菌株种间多样性的分析，鲜见报道。本研究旨在通过微生物富集、分离、纯化获得青海湖可培养嗜盐菌种质资源，研究其耐盐特性；通过16S rDNA序列分析构建系统发育树，研究青海湖可培养嗜盐菌的种群进化关系；通过PCR扩增青海湖中10株盐单胞菌属菌株16S rDNA序列和16S-23S间隔序列，采用测序、Blast对比以及RFLP等方法分析这10株嗜盐菌的序列差异，并结合SDS-PAGE技术方法研究其全菌体蛋白的种间差异，以期了解青海湖嗜盐菌菌种资源的分布状况，为后续应用开发奠定坚实的基础。方法采集青海湖不同区域水样20份，采用RM培养基（不同盐度），筛选分离、纯化培养获得嗜盐菌种质资源；在RM固体培养基上观察菌落形态，采用革兰氏染色法在光镜下观察菌体形态特征；采用不同NaCl浓度梯度的RM培养液，对纯化菌株进行耐盐度测定，依据嗜盐菌分类标准初步进行分类；采用单因素实验，测定不同温度、pH值和Mg2+浓度对其生长的影响；参照细菌鉴定手册测定不同碳源、不同氮源对各菌株生长影响的试验；利用微生物生理生化鉴定测试项目，初步鉴定中度嗜盐菌，并进行种属定位分析。提取青海湖可培养嗜盐菌菌株总DNA，以总DNA为模板扩增16S rDNA片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化回收并测序，并将序列提交至NCBI数据库。基于16S rDNA序列，采用MAGE4.0软件构建系统进化树，并进行16SrDNA RFLP分析、16S-23S rDNA ISR分析和全菌体蛋白SDS-PAGE分析，确定其种间分子进化差异和系统学分类单元。结果从20份青海湖水样分离出青海湖嗜盐微生物种质资源35株，其中细菌34株，真菌1株。在菌落形态特征上，圆形或椭圆形占88.57%，颜色以白色或乳白色居多，其中因天然色素存在于一些菌体中，菌落呈红色、橙红色、黄色或淡蓝色，约占40%。在显微形态上多为长杆或短杆状，约占80%，球形或弧形约占14.28%，丝状约占5.7%，革兰氏阴性菌占74.28%。通过耐盐梯度实验，35株青海湖嗜盐菌以中度嗜盐菌为主，约占62.85%，轻度嗜盐菌约占22.85%，非嗜盐菌与耐盐菌约占14.28%，未分离出边界和极端嗜盐菌，据此确定中度嗜盐菌为青海湖嗜盐菌生长优势种群类型。从初步分离获取的22株中度嗜盐微生物中，选择最适生长盐度范围较宽泛的典型菌株15株，进行生长特性研究，结果表明青海湖中度嗜盐微生物能在1045℃生长温度范围生长，其中一些菌株甚至能在5℃生长，此与青海湖地处高原地区环境有关。22株中度嗜盐菌能在pH为5.511的范围内生长，且最适pH均大于7.5，此与地区盐碱化环境密切相关，具有嗜盐兼嗜碱的特性。因菌种属性的差异，中度嗜盐菌对Mg2+的生长需求不同，耐受程度亦不同，最大浓度达到1.6mol/L。碳氮源利用实验结果显示，大多数青海湖中度嗜盐菌能以果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、海藻糖和纤维二糖作为碳源生长；其它碳源利用，因菌株差异而不同。在氮源利用方面，大多数菌株能利用酵母抽提物、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾、硝酸钠和硝酸钙进行生长，不能在亚硝酸钠中生长。通过提取细菌基因组DNA和16S rDNA测序，构建系统发育树，得出青海湖可培养嗜盐菌的种群发育主要有4个进化分支单元，分别为γ-变形菌纲、厚壁菌门、放线菌门和α-变形菌纲，隶属于14个不同的属类群。基于16S rDNA分析得出35株青海湖嗜盐菌中有10株菌株同属于γ-变形菌纲海洋螺菌目盐单胞菌科盐单胞菌属，为革兰氏阴性菌，属中度嗜盐菌范畴（盐度范围0.4～3.5mol/L，最适盐度0.5～2.0mol/L），但形态特征和生长特性具有明显的差异。通过对10株盐单胞菌属菌株进行16S-23S rDNA ISR多态性分析、全菌体蛋白SDS-PAGE分析和16SrDNA分析，可初步确定10株菌株可分7个种进化分支单元，证实10株盐单胞菌属菌株在种间分子水平差异具有高度的一致性，同时验证了分子表型特性的多相研究对种单元初分类具有重要意义。结论立足高原地区生态环境的优势，本研究首次分离了35株青海湖嗜盐菌株，并对其进行了的16S rDNA基因序列同源性，初步分析了青海湖可培养嗜盐菌的种群多样性，为后期获得和利用相关耐盐基因提供了基础，也为将嗜盐菌应用于农业抗盐碱化工程、高盐污水处理系统提供理论支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品
• 1.1.2 主要试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株分离和形态特征研究
• 1.2.2 生长特性研究
• 1.2.3 生理生化特性研究
• 1.2.4 基因组 DNA 的提取
• 1.2.5 PCR 扩增 16S rDNA 研究
• 1.2.6 凝胶纯化回收
• 1.2.7 构建系统发育树
• 1.2.8 10 株盐单胞菌属菌株种间分子多样性研究
• 第二章 青海湖嗜盐菌的筛选和分离
• 2.1 样品采集
• 2.2 富集分离与菌落形态
• 第三章 生长特性研究与初步分类
• 3.1 嗜盐特性与分类统计
• 3.2 温度、pH 与 Mg2+
• 第四章 中度嗜盐菌生理生化的鉴定
• 4.1 中度嗜盐菌碳氮源利用情况
• 4.2 中度嗜盐菌生理生化分析
• 第五章 基因组 DNA 的提取与 16S rDNA 鉴定
• 5.1 DNA 提取
• 5.2 16S rDNA PCR 扩增
• 第六章 系统发育树的构建
• 6.1 青海湖嗜盐菌类群分布
• 6.2 系统发育分析
• 6.3 种群多样性指数统计分析
• 第七章 10 株盐单胞菌属种间分子多样性分析
• 7.1 种属定位与分析
• 7.2 16S rDNA 鉴定系统发育分析
• 7.3 16S rDNA 基因 PCR-RFLP
• 7.4 16S-23S rDNA ISR 多态性分析
• 7.5 全菌体蛋白 SDS-PAGE 分析
• 讨论与总结
• 参考文献
• 附录
• 附录 1 综述
• 参考文献
• 附录 2 采样和分菌
• 附录 3 嗜盐菌 16S rDNA 序列
• 附录 4 英文缩略语表
• 致谢
• 攻读学位期间取得的研究成果