论文摘要
背景与目的髓母细胞瘤是儿童期最常见的恶性肿瘤之一。已知,它起源于小脑外胚层的前体颗粒细胞,但有关其发生的分子机制还不十分明了,有待深入研究。大量临床资料显示,在由癌症引起死亡的儿童患者中,髓母细胞瘤占25%。通过临床上常用的诸如手术切除、放疗和化疗以及它们的联合治疗等手段,虽有70%的患儿得以存活,但其中大部分患儿要忍受这些治疗给身体带来的直接伤害和长期的药物毒副作用。因此,寻求更为可靠、毒副作用更低的辅助性治疗方法具有重要的临床意义。髓母细胞瘤是原始多能神经干细胞在成熟分化过程中受阻,从而停滞在某种未成熟的、持续增殖的状态。因此在合适的分化诱导剂的作用下,髓母细胞瘤有继续分化的潜能。全反式维甲酸能够抑制髓母细胞瘤细胞的生长,促进其分化,但并不能诱导髓母细胞瘤细胞凋亡,其作用具有可逆性。白藜芦醇是普遍存在于葡萄等多种天然植物中的多酚类化合物,是一种很具潜力的肿瘤化学预防剂。我们的前期研究表明,该化合物不仅能促进髓母细胞瘤细胞分化、抑制其增殖,还能有效诱导髓母细胞瘤细胞凋亡。我们近来发现,白藜芦醇能够抑制c-Myc的表达,引起髓母细胞瘤细胞的S期阻滞。这提示,抑制c-Myc的表达可能是白藜芦醇抗髓母细胞瘤作用中关键的分子事件。但是,与白藜芦醇处理的效果不同,用反义寡核苷酸来阻断c-Myc的表达只引起髓母细胞瘤细胞的凋亡,而不引起其分化,这表明在白藜芦醇诱导髓母细胞瘤分化的过程中,还有其他的分子事件参与到这一过程。最近的细胞分子生物学研究结果表明,机体的正常发育和肿瘤形成有着某些相似的特征。这两个过程都涉及信号传导、细胞增殖、分化、迁移和死亡等基本过程。因此,某些参与发育和分化的基因如果出现表达失调,就会使细胞死亡或者导致肿瘤发生。Wnt和Notch即是两个在原始神经干细胞成熟分化和中枢神经系统发育过程中起重要作用的信号传导蛋白家族,并以各自的传导通路对靶细胞发挥作用。Notch胞内活性片段NICD（Notch Intracellular Domain, NICD）的释放及核易位是Notch信号通路活化的关键,NICD入核后可激活下游靶基因如Hes1等的转录。研究证实,在正常和病理条件下,Notch信号通路均可以调节细胞增殖和分化,而白藜芦醇也可以起到类似的作用。目前,在髓母细胞瘤或其他类型的肿瘤中,白藜芦醇对Notch信号通路的影响至今尚未见报道。探明白藜芦醇对Notch1和Notch2表达的影响,探讨Notch信号通路的活化状态与白藜芦醇抗髓母细胞瘤作用的相关性是本研究的目的之一。诸多研究结果表明,肿瘤形成是多个信号转导途径紊乱的结果。与Notch信号通路相似,Wnt信号转导途径不但在神经形成过程中发挥作用,还与髓母细胞瘤和其他肿瘤如结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等发生密切相关。它参与细胞命运的决定,影响细胞的增殖和分化。Wnt信号途径功能的实现依赖于Wnt信号表达上调,导致β-catenin易位于细胞核,与TCF/LEF结合形成复合物,该复合物通过与靶基因启动子区域的TCF/LEF结合区域的序列相作用,解除TCF/LEF对下游靶基因的转录抑制而启动靶基因的转录。业已发现,在髓母细胞瘤中常见β-catenin的突变,偶尔也可见APC和axin基因的突变。所有这些突变都会阻碍β-catenin的降解,引起Wnt途径的紊乱。虽然这些结果提示Wnt信号途径与髓母细胞瘤的发生存在一定的关联,但最近也有学者提出Wnt信号途径的作用具有组织特异性,其活化通常在髓母细胞瘤中预示着良好的预后。普遍认为,原癌基因c-Myc的过表达与髓母细胞瘤的发生和发展密切相关。而我们的研究表明,白藜芦醇能够有效抑制c-Myc的表达。已知,c-Myc是Wnt途径的靶基因之一,而在髓母细胞瘤中可见Wnt家族成员的表达。我们因此推测,白藜芦醇引起的c-Myc的下调可能是由于Wnt途径受到抑制的结果。验证这一推测进而寻求髓母细胞瘤治疗的新靶点是本研究的目的之二。材料与方法髓母细胞瘤及瘤旁相对正常小脑组织来由大连医科大学第一附属医院病理科和中国医科大学盛京医院病理科提供。实验所用人髓母细胞瘤细胞系Med-3由日本神户大学神经外科建立和提供,另外两个细胞系UW228-2和UW228-3由华盛顿大学（西雅图）神经肿瘤学实验室提供。本研究基于石蜡组织微阵列技术,利用免疫组织化学染色检测Notch和Wnt信号通路在髓母细胞瘤中的活化状态,分析探讨相关靶基因的表达特点;通过流式细胞仪、MTT检测及台盼蓝计数分析不同培养条件下三种髓母细胞瘤细胞增殖活性的变化;采用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western蛋白印迹分析等方法,检测白藜芦醇处理前后三个髓母细胞瘤细胞系中Notch和Wnt信号通路活化状态的改变,分析探讨相关靶基因的表达特点。实验数据采用SPSS12.0软件包应用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney检验方法进行统计分析。结果一、Notch和Wnt信号通路在髓母细胞瘤中的状态1. Wnt2,β-catenin,TCF4和Hes1在髓母细胞瘤中的表达明显低于瘤旁相对正常的小脑组织（p<0.05）。2. Notch1和Notch2在髓母细胞瘤中的表达低于瘤旁相对正常的小脑组织（p>0.05）。3. Wnt下游靶基因cyclin D1,c-Myc,VEGF和survivin在髓母细胞瘤中的表达水平均明显高于瘤旁相对正常的小脑组织（p<0.05）。4. Wnt5a在髓母细胞瘤和瘤旁相对正常小脑组织间的表达水平无显著差异（p>0.05）。二、白藜芦醇对髓母细胞瘤的作用1.白藜芦醇抑制髓母细胞瘤细胞生长,促进其细胞分化和凋亡流式细胞仪检测结果显示,白藜芦醇在诱导髓母细胞瘤细胞凋亡的同时,以时间依赖性方式将Med-3,UW228-2和UW228-3细胞的细胞周期阻滞在G1期。2.白藜芦醇处理后的细胞突触素呈阳性表达免疫细胞化学染色和RT-PCR结果显示,神经元的分化标记物-突触素（synaptophysin,SYP）在白藜芦醇处理后的三个髓母细胞瘤细胞系（Med-3,UW228-2和UW228-3）中表达增强。3.丝氨酸蛋白酶抑制剂B6（SPIB6,粒酶B的抑制剂）的表达RT-PCR结果显示,在正常培养组的UW228-2和-3细胞中,可检测到SPIB6（570bp）,而在白藜芦醇处理后,此扩增产物消失。三、白藜芦醇对髓母细胞瘤Notch信号通路的调节作用1.白藜芦醇可上调UW228-2和-3细胞中Notch1和Notch2的表达,并促进其核易位RT-PCR、免疫细胞化学、免疫荧光检测及Western蛋白印迹分析的结果显示,白藜芦醇处理后,UW228-2和-3细胞中Notch1和Notch2呈上调表达,且发生明显核易位。但白藜芦醇并未改变Med-3细胞中Notch1和Notch2的表达水平及在细胞内的分布状况。2. Hes1在白藜芦醇处理细胞中的核易位免疫细胞化学和免疫荧光检测的结果显示,在处理组UW228-2和-3细胞中Hes1的表达强度增加,尤其是在那些具明显分化形态的细胞中,荧光（Hes1）强度增加更明显（图2a）。在白藜芦醇处理前后的Med-3细胞中,Hes1的表达强度及在细胞内的分布位置并无明显变化。四、Notch通路活化与白藜芦醇抗髓母细胞瘤作用的相关性1.γ-secretase的抑制剂对Notch信号通路的阻断作用免疫细胞化学的染色结果显示:8μM的L-685,458作用36小时和10μM DAPT作用48小时均可以显著减弱Notch靶基因-Hes1在胞浆中的表达,抑制其核易位。2.γ-secretase的抑制剂对髓母细胞瘤细胞的生长无影响MTT和Typran Blue计数结果表明:8μM L-685,458或10μM DAPT并未抑制细胞（Med-3,UW228-2和-3）增殖或诱导细胞凋亡。3. Notch信号通路的阻断不影响白藜芦醇的抗髓母细胞瘤作用MTT检测结果表明,单纯白藜芦醇处理组和白藜芦醇与γ-secretase抑制剂共处理组间细胞增殖活性无显著性差异（p>0.05）。五、白藜芦醇对髓母细胞瘤Wnt通路的影响1.白藜芦醇可活化髓母细胞瘤细胞中的Wnt信号通路RT-PCR结果显示,在白藜芦醇处理组UW228-2和-3细胞中Wnt2,TCF4和LEF1呈上调表达。免疫细胞化学和免疫荧光的结果显示,在白藜芦醇处理后的细胞中β-catenin和TCF4出现了明显的核易位。2.在白藜芦醇处理后的髓母细胞瘤细胞中Ngn1（Neurogenin1）呈上调表达在白藜芦醇处理组UW228-2,-3细胞中Ngn1呈上调表达,且在UW228-3细胞中上调表达的趋势更为明显。结论一、Notch和Wnt信号通路分别在77.8%和84.2%的髓母细胞瘤中处于非活化状态,提示髓母细胞瘤的发生与Notch和Wnt信号通路的失活存在一定的关联。二、白藜芦醇在诱导髓母细胞瘤细胞细胞凋亡的同时,以时间依赖性方式将Med-3和UW228-2,-3细胞的细胞周期阻滞在G1期,并促进细胞向神经元方向分化。三、白藜芦醇可上调UW228-2和-3细胞中Notch1和Notch2的表达,并促进其核易位,Hes1表达强度的增加及其在细胞核的出现,提示白藜芦醇可促进髓母细胞瘤细胞中Notch信号通路的活化。四、γ-secretase的抑制剂可阻断Notch信号通路,但并未抑制细胞（Med-3,UW228-2和-3）增殖或诱导细胞凋亡,也未影响白藜芦醇的抗髓母细胞瘤作用。五、白藜芦醇促进UW228-2和-3细胞中β-catenin的核易位,上调TCF4的表达水平,提示白藜芦醇可促进髓母细胞瘤细胞中Wnt信号通路的活化。六、c-Myc等Wnt下游靶基因的下调表达可能是许多信号通路协同作用的结果。提示髓母细胞瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路的作用可能具有细胞异质性。七、突触素（SYP）和粒酶B抑制剂（SPIB6）的拮抗性表达可能与髓母细胞瘤细胞的分化和凋亡之间存在某种潜在的联系,值得我们今后做更深入的探讨。