离体大鼠肝脏灌流液蛋白质组研究

论文摘要

离体大鼠肝脏灌流是一项广泛应用于肝脏生理功能研究的技术,在合适的灌流条件下,灌流肝脏可在一定的时间窗内保持结构完整。蛋白质组学技术具有大规模、高通量的特点。本论文第一部分将这两种技术结合,尝试在器官水平上全面完整地研究肝脏的分泌功能。在该类型研究中,主要有两大问题：一是如何保持肝脏器官的结构完整,二是控制灌流液中的血污染。我们一方面调整并控制了器官灌流条件来减少灌流损伤和降低血污染,另一方面以灌流液中的谷丙转氨酶量来评判肝脏损伤情况,以灌流液中的免疫球蛋白IgG量作为灌流液血污染程度的指标。我们选取谷丙转氨酶水平较低和肉眼观没有明显血污染的灌流液进行了后续研究。同时Western Blot和后续的质谱鉴定均显示灌流液中的IgG水平较低,提示灌流液中血污染较少。应用二维毛细管液相色谱（强阳+反相）与质谱联用方法,在鉴定假阳性率约1%的基础上,共获得了886个灌流液蛋白鉴定。在这些蛋白中有423个蛋白被Swiss-Prot注释,其中分泌蛋白的比例相对于肝脏全组织蛋白组数据有高达5倍的富集；在富集指数方法富集的部分,分泌蛋白的比例则有约10倍的富集。应用信号肽预测方法和富集指数方法,我们共获得357个可能分泌蛋白,其中有49个非经典途径分泌蛋白被富集指数方法以较高可信度富集。在这些分泌蛋白中,我们发现有71个蛋白参与信号传导通路,其中61个蛋白在胞外发挥作用。通过对这些蛋白的功能分析,我们实现了在器官水平和蛋白质组学广度上研究肝脏分泌功能。灌流液含有在灌流条件下器官水平的组织间隙液蛋白,其富含疾病标志物。正常大鼠肝脏灌流液蛋白中胞内蛋白部分为肝脏灌流损伤所致。在这些蛋白中,我们发现许多蛋白有文献报道与损伤相关或已为肝脏损伤标志物。我们认为在离体器官灌流液中寻找潜在的标志物而在血液或尿液中进行验证,可能是寻找疾病标志物的较好策略。在论文的第二部分,我们建立了Walker-256肿瘤细胞肝脏转移模型,通过比较模型组与对照组之间的离体大鼠肝脏灌流液的差异,获得了该肿瘤细胞转移后肝脏灌流液中的差异蛋白。结果显示：110个蛋白在模型组中增高,其中分泌蛋白为46个；70个蛋白在模型组中降低,分泌蛋白为60个。下降的蛋白主要为分泌蛋白且为常见的肝脏分泌蛋白,提示肿瘤转移后肝脏的分泌功能下降,这可能与Walker-256转移所致恶液质有关。我们挑取了4个在灌流液中明显增高的蛋白,应用Western Blot方法在血清中进行验证,拟探讨离体大鼠肝脏灌流液在肝脏疾病标志物研究中的价值。

论文目录

• 序言
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 利用离体大鼠肝脏灌流液研究肝脏器官分泌功能
• 前言
• 技术路线
• 第一章 离体大鼠肝脏灌流液的收集和质量评价
• 1.1.引言
• 1.2.材料与方法
• 1.3.离体大鼠肝脏灌流示意图
• 1.4.样品处理路线图
• 1.5.结果与讨论
• 1.5.1.离体大鼠肝脏灌流方法建立及改进
• 1.5.2.离体大鼠肝脏灌流液的选择
• 1.5.3.灌流液以及相应胞内蛋白样和血清样品处理
• 1.5.4.灌流液样品中的血污染和胞内蛋白污染评价
• 1.6.小结
• 第二章 灌流液蛋白质谱鉴定
• 2.1.引言
• 2.2.材料与方法
• 2.3.结果和讨论
• 2.3.1.灌流液样、胞内蛋白样和血清样蛋白质谱鉴定
• 2.3.2.灌流液蛋白初步分析
• 2.4.小结
• 第三章 基于富集指数方法获得肝脏分泌蛋白
• 3.1.引言
• 3.2.实验方法
• 3.3.富集指数方法研究分泌蛋白质的原理图
• 3.4.结果和讨论
• 3.4.1.基于谱图定量的富集指数原理获得肝脏分泌蛋白
• 3.4.2.基于谱图定量的富集指数原理获得高可信肝脏分泌蛋白
• 3.5.小结
• 第四章 基于生物信息学方法预测灌流液中分泌蛋白
• 4.1.引言
• 4.2.实验方法
• 4.3.结果和讨论
• 4.3.1.灌流液富集了含有分泌信号肽的蛋白
• 4.3.2.灌流液中富集了Swiss-Prot注释的分泌蛋白
• 4.4.小结
• 第五章 基于分泌信号肽预测和基于富集指数原理获得分泌蛋白的方法比较
• 5.1.引言
• 5.2.实验方法
• 5.3.结果和讨论
• 5.4.小结
• 第六章 灌流液分泌蛋白分析
• 6.1.引言
• 6.2.实验方法
• 6.3.结果和讨论
• 6.3.1.灌流液中常见的肝脏分泌蛋白
• 6.3.2.灌流液中非经典途径肝脏分泌蛋白
• 6.3.3.灌流液中分泌蛋白与既往肝脏分泌蛋白组结果重叠率较低
• 6.3.4.灌流液中分泌蛋白的GO功能分类
• 6.3.5.灌流液中分泌蛋白富集了应激反应蛋白
• 6.4.小结
• 参考文献
• 第二部分 利用离体大鼠肝脏灌流液发现疾病标志物
• 前言
• 技术路线
• 第一章 正常大鼠离体肝脏灌流液含有丰富的疾病标志物
• 1.1.引言
• 1.2.结果和讨论
• 1.2.1.灌流液中的损伤相关蛋白
• 1.2.2.灌流液中的营养不良相关蛋白
• 1.3.小结
• 第二章 大鼠Walker-256肝转移癌的建立
• 2.1.引言
• 2.2.材料与方法
• 2.3.结果和讨论
• 2.4.小结
• 第三章 肝脏灌流液的收集和质量评价
• 3.1.引言
• 3.2.材料和方法
• 3.3.结果和讨论
• 3.3.1.灌流时间点的确定
• 3.3.2.灌流实验基本情况
• 3.3.3.样品中血污染和胞内污染评价
• 3.4.小结
• 第四章 Walker-256癌细胞肝转移后肝脏灌流液差异蛋白质组分析
• 4.1.引言
• 4.2.材料与方法
• 4.3.结果和讨论
• 4.3.1.模型组和对照组灌流液全蛋白质组分析
• 4.3.2.基于谱图半定量方法获得差异蛋白谱
• 4.3.3.基于生物信息学预测方法获得差异分泌蛋白谱
• 4.3.4.Walker-256肿瘤细胞肝转移所致差异分泌蛋白分析
• 4.3.5.高可信差异分泌蛋白
• 4.4.小结
• 第五章 Walker-256癌细胞肝转移后肝脏灌流液差异蛋白验证
• 5.1.引言
• 5.2.材料与方法
• 5.3.结果与讨论
• 5.4.小结
• 参考文献
• 第三部分 文献综述 甲醛固定—石蜡包埋组织蛋白质组学
• 附录
• 第一部分 附表1
• 第一部分 附表2
• 第二部分 附表1
• 彩图
• 简历
• 致谢