深海适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的适冷蛋白酶MCP-01的基因克隆和自溶研究

论文题目: 深海适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的适冷蛋白酶MCP-01的基因克隆和自溶研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 潘军

导师: 曲音波,张玉忠

关键词: 适冷蛋白酶,基因克隆,自溶,海藻糖

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 海洋中有着丰富的微生物资源,是获取新药和新酶等的宝贵资源,具有很好的开发前景。极端环境微生物是微生物学领域中研究的热点,而适冷菌是极端微生物中的一类。深海海底终年低温,因而是分离适冷菌和适冷酶的良好材料。适冷酶在低温下具有较高的催化效率,在需要低温催化的行业如洗涤、食品、奶制品、皮革加工、医药和化妆品中具有较高的应用价值,因而引起各国科学家的广泛研究和开发。自1999年以来,山东大学开展了对海洋适冷微生物和适冷酶的研究。陈秀兰等(2001)从1855米深的海底淤泥中分离到一株产适冷蛋白酶的适冷菌P. sp. SM9913。该菌株所产的适冷蛋白酶MCP-01具有典型的适冷特征。适冷蛋白酶MCP-01在低温下具有高的催化效率,对热很敏感,而且易自溶(Chen et al, 2002, Chen et al, 2003a; Chen et al, 2003b)。在此研究基础上,本论文首先对适冷菌P. sp. SM9913做了种属鉴定,然后对适冷蛋白酶MCP-01进行了基因克隆和结构分析,并对适冷蛋白酶MCP-01的自溶机制和糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响进行了研究。 1、产适冷蛋白酶的适冷菌SM9913的种属鉴定根据适冷菌SM9913的形态特征和生理生化特征,曾鉴定适冷菌SM9913属于Pseudomonas属。本文根据大肠杆菌16SrDNA的保守序列设计引物,克隆了适冷菌SM9913的16SrRNA基因。利用blast软件,将适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列与GenBank库中的16SrRNA基因序列进行同源分析,结果表明适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列与Pseudoalteromonas属的多株菌的同源性最高(98～99%),表明适冷菌SM9913属于Pseudoalteromonas属。利用BIOLOG微生物鉴定系统分析了适冷菌SM9913对95种碳源的利用情况,结果适冷菌SM9913的碳源利用特征与Pseudoalteromonas属一致。因此,适冷菌SM9913属于Pseudoalteromonas属。根据对适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列和Pseudoalteromonas属的菌的

论文目录:

摘要

英文摘要

第一章研究背景与立题依据

1．1 研究背景

1．1．1 适冷微生物研究进展

1．1．1．1 适冷微生物的定义

1．1．1．2 适冷微生物的多样性及分布

1．1．1．3 适冷微生物的适冷特征

1．1．1．4 适冷微生物的应用

1．1．2 适冷酶研究进展

1．1．2．1 适冷酶简介

1．1．2．2 适冷酶的适冷催化特征

1．1．2．3 适冷酶的结构特征

1．1．2．4 适冷酶的基因克隆、表达和改造

1．1．2．5 适冷酶的应用

1．2 立题依据

1．2．1 蛋白酶及其应用

1．2．1．1 蛋白酶的分类

1．2．1．2 蛋白酶的应用

1．2．2 适冷蛋白酶及其研究进展

1．2．2．1 适冷蛋白酶的来源

1．2．2．2 适冷蛋白酶的特征

1．2．2．3 适冷蛋白酶的应用

1．2．3 我国适冷菌、适冷酶和海洋微生物的研究状况

1．2．4 本论文的研究基础和内容

1．2．4．1 本论文的研究基础

1．2．4．2 本论文的研究内容

第二章深海适冷菌株 SM9913的种属鉴定

2．1 材料和方法

2．2 结果与分析

2．2．1 深海适冷菌P．sp． SM9913的16SrDNA的克隆

2．2．1．1 深海适冷菌P．sp．SM9913基因组 DNA的提取

2．2．1．2 深海适冷菌P．sp． SM9913的16SrDNA的克隆

2．2．1．3 PmT-16SrDNA重组质粒的构建

2．2．1．4 重组质粒 PmT-16SrDNA的转化及重组子的筛选和鉴定

2．2．2 深海适冷菌P． sp． SM9913的16SrDNA的序列测定和同源性分析

2．2．2．1 深海适冷菌P．sp．SM9913的16SrDNA的序列测定

2．2．2．2 深海适冷菌P．sp． SM9913的16SrDNA的同源性分析

2．2．3 深海适冷菌P．sp． SM9913的唯一碳源实验

2．2．4 深海适冷菌P． sp． SM9913菌株的系统进化分析

2．3 讨论

第三章深海适冷蛋白酶 MCP-01的基因克隆和结构分析

3．1 材料和方法

3．2 结果与分析

3．2．1 深海适冷蛋白酶 MCP-01的活性中心保守片断M4的克隆和测序

3．2．1．1 引物设计

3．2．1．2 深海适冷菌 P． sp．SM9913基因组 DNA的提取

3．2．1．3 蛋白酶 MCP-01的活性中心保守片断M4的克隆

3．2．1．4 PmT-M4重组质粒的构建

3．2．1．5 重组质粒 PmT-M4的转化及重组子的筛选和鉴定

3．2．1．6 DNA片断M4的序列测定和同源性分析

3．2．2 蛋白酶 MCP-01的基因克隆

3．2．2．1 深海适冷菌P．sp． SM9913部分基因组文库的建立

3．2．2．2 利用菌落原位杂交寻找带有蛋白酶MCP-01基因的阳性菌落

3．2．2．3 DNA片断MCP的测序和分析

3．2．2．4 通过TAIL PCR克隆蛋白酶MCP-01N端部分基因序列

3．2．2．5 蛋白酶MCP-01的基因序列和同源性分析

3．2．2．6 基因MCP-01的启动子分析

3．2．3 蛋白酶MCP-01的结构分析

3．2．3．1 蛋白酶MCP-01的一级结构的推导和分析

3．2．3．2 蛋白酶MCP-01的高级结构分析

3．3 讨论

第四章深海适冷蛋白酶MCP-01的自溶机制

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．2．1 适冷蛋白酶MCP-01的纯化

4．2．2 浓度对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

4．2．2．1 不同浓度的适冷蛋白酶MCP-01的制备

4．2．2．2 不同浓度的适冷蛋白酶MCP-01在30下的自溶研究

4．2．3 不同pH下温度对适冷蛋白酶MCP-01自溶和热稳定性的影响

4．2．3．1 温度对在pH6．5，50mmol/L Tris缓冲液中蛋白酶MCP-01自溶和热稳定性的影响

4．2．3．2 温度对在pH7．5，50mmol/L Tris缓冲液中蛋白酶MCP-01自溶和热稳定性的影响

4．2．3．3 温度对在pH8．5，50mmol/L Tris缓冲液中蛋白酶MCP-01自溶和热稳定性的影响

4．2．4 pH对适冷蛋白酶 MCP-01自溶的影响

4．2．4．1 在50mmol/L Tris缓冲液中pH对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

4．2．4．2 在50mmol/L硼酸缓冲液中pH对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

4．3 讨论

第五章糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．2．1 海藻糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．2．1．1 海藻糖对不同浓度适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．2．1．2 海藻糖对不同pH的适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．2．2 蔗糖对适冷蛋白酶 MCP-01自溶的影响

5．2．3 三种单糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．3 讨论

参考文献

本论文的创新性结果

在读博士期间发表的论文

致谢

学位论文评阅及答辩情况表

发布时间: 2005-10-17

参考文献

[1].不同倍性鱼HPG轴生殖基因的表达及性别决定的机制研究[D]. 王道.湖南师范大学2013
[2].三种养殖扇贝热休克蛋白HSP70在逆境因子下的表达和相关基因的克隆[D]. 曲凌云.中国科学院研究生院（海洋研究所）2004
[3].文昌鱼分子生物学：AmphiSRP19、AmphiLysC与AmphiS19基因克隆、表达和进化研究[D]. 刘梅.中国海洋大学2004
[4].人类激酶基因CK1γ1L2和PDIK1L的克隆和功能研究[D]. 郭凌晨.复旦大学2004
[5].人类SCDR10B、LHFPL1和CYPJ基因的克隆及其编码蛋白的特征与功能研究[D]. 黄超群.复旦大学2004
[6].灰飞虱免疫相关基因及微管蛋白基因的克隆和分子鉴定[D]. 温建国.复旦大学2004
[7].HN1家族基因和PNO1基因的克隆和功能初步研究[D]. 周光金.复旦大学2004
[8].费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的克隆和功能研究[D]. 姜巨全.中国农业大学2005
[9].角蛋白降解菌Streptomyces fradiae var.k-11中蛋白酶基因的克隆及表达[D]. 李江.中国农业科学院2005
[10].睾丸特异蛋白激酶TSSK4的基因克隆及功能初探[D]. 陈秀娟.复旦大学2005

深海适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的适冷蛋白酶MCP-01的基因克隆和自溶研究

猜你喜欢