论文题目: 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种mip-like基因的鉴定及功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理学
作者: 臧宁
导师: 唐纪良
关键词: 基因,基因,肽基脯氨酰基顺反异构酶,致病基因
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 巨噬细胞侵染增强因子Mip（macrophage infectivity potentiator,Mip）是人的病原细菌嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）中的重要致病因子,它属于FKBP类型的肽基脯氨酰基顺反异构酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase,PPIase）（FKBPs）。Mip或Mip-like蛋白也是其它一些人或动物病原生物如Q热立克次体（Coxiella burnetii）和沙门伤寒氏菌（S.typhimurium）的致病因子。在植物病原细菌中,只有木质部难养细菌（Xylella fastidiosa）基因组中注释了一个名为mip-like的基因,至于mip-like在其它植物病原细菌中是否存在以及其生物学功能未见报道。本研究中,我们用木质部难养细菌的Mip-like蛋白的氨基酸序列去搜索野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）（该菌是引起十字花科植物黑腐病的病原菌）8004菌株的基因组,发现基因XC2699（原来注释为肽基脯氨酰基顺反异构酶）与木质部难养细菌的mip-like基因和嗜肺军团菌的mip基因在氨基酸水平上分别有85%和49%的相似性。为此,我们将XC2699重新命名为mip-like。 为了确定ORF2699编码的产物是否是一个肽基脯氨酰基顺反异构酶以及其类型,我们将该ORF2699的编码区序列克隆到载体pET-30上并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行过量表达,然后将带有六组氨酸标记的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Mip—like融合蛋白纯化,并用蛋白酶偶联法,以N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide为底物测定了该蛋白的PPIase酶活性,结果证实纯化后的目标蛋白具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性;其Km和Kcat值分别为21.72mM和7.2×104S-1,Kcat/Km为3.29×106M-1S-1。酶活性抑制特性测定结果表明,其活性能被免疫抑制药物FK506特异抑制而不受另一种免疫抑制药物环孢菌素A（clycosporin A）抑制。这些结果证明XC2699是一个mip-like基因,Xcc Mip-like蛋白是一个FKBP类肽基脯氨酰基顺反异构酶。 为了确定Mip-like蛋白在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的生物学功能,我们利用自杀质粒pK18mob整合突变方法构建了mip-like基因的非极性突变体,并在寄主植物满身红萝卜（Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.）上用剪叶法测定了其致病性,结果发现,接种十天后,接种mip-like突变体NK2699的叶片的平均病斑长度为2.3mm,而接种野生型菌株8004的叶片的平均病斑长度为15.1mm,而且突变体致病性的降低能被一个野生型的mip-like基因反式互补（接种互补菌株CNK2699的叶片的平均病斑长度为13.6mm）。这一结果证明mip-like基因是Xcc致病所需要的。为了了解mip-like基因影响致病的机制,我们进一步检测了该突变体在培养基上的生长情况以及致病因子产生情况,结果发现（ⅰ）mip-like突变体NK2699在NYGA培养基上的生长与野生型菌株8004基本一致;但在基本培养基上该突变体的生长非常差,而野生型菌株和互补菌株生长良好;（ⅱ）mip-like突
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 植物病原细菌的致病因子及致病基因
1.1.1 胞外多糖
1.1.2 脂多糖
1.1.3 胞外酶
1.1.4 毒素
1.1.5 依赖于Ⅲ型分泌系统(TTSS)的效应物
1.2 动植物病原菌致病机制的相似性
1.3 巨噬细胞感染增强子(Mip)研究概况
1.4 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病机制研究进展
第二章 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 研究用细菌菌株
2.1.2 研究用质粒
2.1.3 研究用引物
2.2 抗生素
2.3 培养基
2.4 溶液
2.5 实验用菌株的培养条件和保存方法
2.5.1 菌株培养条件
2.5.2 菌株保存方法
2.6 Xcc总DNA提取
2.7 质粒提取
2.8 PCR扩增
2.9 DNA片段纯化
2.10 限制性内切酶酶切
2.11 DNA连接
2.12 转化实验
2.12.1 感受态细胞的制备
2.12.2 细菌细胞的转化
2.13 琼脂糖凝胶电泳
2.14 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.14.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
2.14.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.14.3 考马斯亮蓝染色
2.15 6×His蛋白的表达和纯化
2.15.1 目的基因在表达载体上的克隆
2.15.2 目的蛋白的表达
2.15.3 目的蛋白的纯化
2.16 肽基脯氨酰基顺反异构酶酶活性及Km和Kcat的测定
2.16.1 PPIase酶活性的测定
2.16.2 肽基脯氨酰基顺反异构酶的抑制物对酶活性影响的测定
2.16.3 肽基脯氨酰基顺反异构酶的Km和Kcat的测定
2.17 整合突变体的构建及其验证
2.17.1 非极性整合突变体的构建
2.17.2 非极性整合突变体的验证
2.18 定点突变——引物介导法
2.19 互补株的构建
2.20 植株致病性实验
2.21 病原菌生长特性检测
2.21.1 在萝卜叶内的生长检测
2.21.2 在培养基中的生长繁殖检测
2.22 过敏性反应实验
2.23 致病因子的检测
2.23.1 胞外多糖的检测
2.23.2 胞外酶的检测
第三章 结果
3.1 植物病原菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004中存在一个Mip-like蛋白
3.1.1 XC2699演绎的氨基酸序列与嗜肺军团菌的Mip蛋白具有同源性
3.1.2 XC2699演绎的蛋白的N-端具有信号肽
3.2 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004的Mip-like蛋白是一个FKBP型的肽基脯氨酰基顺反异构酶
3.2.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004带六组氨酸标签的Mip-like蛋白的纯化
3.2.2 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004的6×His-Mip-like蛋白的酶活性鉴定
3.2.3 6×His-Mip-like蛋白的肽基脯氨酰基顺反异构酶的动力学分析
3.2.4 6×His-Mip-like蛋白的PPIase活性的抑制特性分析
3.3 mip-like基因是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中致病和在寄主体内生长所需要的
3.3.1 mip-like基因非极性整合突变体的构建
3.3.2 mip-like基因突变体的互补菌株的构建
3.3.3 mip-like基因突变体和互补菌株的致病力检测
3.3.4 mip-like基因突变体在植株中的生长的检测
3.3.5 mip-like基因的突变不影响野油菜黄单胞菌野油菜致病变种在非寄主辣椒上的HR反应
3.4 mip-like基因是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种在基本培养基上生长所需要的
3.5 mip-Iike基因是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外酶和胞外多糖产生所需要的
3.5.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的mip-like基因突变对胞外多糖的影响
3.5.2 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的mip-like基因突变对胞外蛋白酶、胞外淀粉酶、胞外纤维素酶活性的影响
3.6 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004的mip-like基因编码的PPIase的酶活性对致病性没有贡献
3.6.1 Xcc Mip-like蛋白的PPIase活性必需氨基酸残基的鉴定
3.6.2 Mip-like突变体蛋白的酶活性分析
3.6.3 Mip-like突变体蛋白的功能分析
第四章 讨论
参考文献
致谢
发布时间: 2006-07-24
参考文献
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