家鸭leptin受体cDNA的克隆分析及外源leptin对家鸭生殖机能的影响

论文摘要

瘦素（leptin）是由白色脂肪组织分泌的一种重要的摄食调控和能量代谢调节因子,不仅参与维持能量代谢的平衡,对动物生长发育、繁殖等生理过程也起着重要的作用。与哺乳动物中的研究相比,leptin在禽类中的研究相对滞后。本文以金定鸭为研究对象,克隆了家鸭leptin受体（leptin receptor,LEPR）2种亚型基因,同时进行了组织器官定位分析;进行了外源leptin对禁食后恢复期家鸭受损卵巢恢复调控的初步探索及可能机制研究。取得了如下结果:（1）以家鸭卵巢cDNA为模板,利用反转录PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术首次克隆了家鸭LEPR两种选择性剪切体LEPR-a和LEPR-b,获得了编码区全部序列,并进行了功能区分析。家鸭的LEPR-b编码区全长3468bp,编码1155个氨基酸,与鸡的LEPR-b蛋白序列同源性达81.7%,与人和鼠的LEPR-b蛋白序列同源性分别为51.9%和50.1%。家鸭的LEPR-b具有哺乳动物LEPR-b中可以激活JAK-STAT信号途径的所有功能区。家鸭LEPR-a是禽类中首次发现的一种LEPR的选择性剪切体,其中编码区全长2670bp,编码889个氨基酸。家鸭LEPR-a与哺乳动物的LEPR-a类似,胞质区只有一个JAK2结合区box,能否激活JAK-STAT途径有待进一步研究。（2）以成年家鸭垂体、性腺、肺、脂肪等14个组织器官样品为研究材料,利用半定量RT-PCR的方法分析了LEPR-a和LEPR-b在家鸭组织器官中的表达特异性,结果表明:LEPR-b在各组织器官中均有表达,其中在垂体,性腺,肺、肾脏、肌肉、脂肪中有高表达;LEPR-a各组织器官中的表达量一般低于LEPR-b,仅在睾丸、小脑和垂体中有大量表达。（3） 2天禁食引起了家鸭卵巢的受损,3天恢复期也不能很好地恢复卵巢状态,表现为卵巢形态的萎缩,组织学上的病变。这些可能与禁食引起的血清E2和P4激素水平的降低,同卵巢中雌激素受体β（estrogen receptor-β,ER-β）、卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor,FSHR）、促黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor,LHR）、1型促性腺激素释放激素（gonadotrophin hormone-releasing hormone-Ⅰ,GnRH-Ⅰ）、生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）和LEPR-b等生殖相关基因mRNA水平表达的降低有关。适当浓度的外源leptin（250μg/kg体重/d）可以促进家鸭受损卵巢的恢复,可能与leptin处理后血清E2水平的上升有关,同卵巢中ER-β、FSHR、LHR、GnRH、GHR、LEPR-b等生殖相关基因mRNA水平表达的增加有关。而同时我们发现高浓度的外源leptin（1000μg/kg体重/d）可能对卵巢恢复有抑制作用,对禁食后恢复期中受损卵巢的恢复不利,与血清E2的降低,卵巢中ER-β、FSHR、LHR、GnRH、GHR、LEPR-b等生殖相关基因mRNA水平表达的降低有关。（4）禁食可以显著抑制家鸭卵巢LEPR-b mRNA的表达,同时外源leptin可以促进卵巢LEPR-b mRNA的表达,并可能直接与其作用来调控家鸭卵巢功能的恢复。而受损卵巢中LEPR-a mRNA的表达量增加,推测卵巢LEPR-a可能作为LEPR-b信号传导过程中的调节因子。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 Leptin概述及禽类leptin
• 1.1.1 Leptin概述
• 1.1.2 禽类leptin概述
• 1.2 LEPR概述与禽类LEPR
• 1.2.1 LEPR概述
• 1.2.2 禽类LEPR概述
• 1.3 Leptin与能量平衡
• 1.3.1 Leptin对摄食的影响
• 1.3.2 Leptin对能量消耗的影响
• 1.3.3 Leptin与禽类能量平衡
• 1.4 Leptin与生长发育
• 1.4.1 Leptin对生长发育的影响
• 1.4.2 Leptin与禽类生长发育
• 1.5 Leptin与繁殖
• 1.5.1 Leptin对生殖相关激素的影响
• 1.5.2 Leptin与青春期启动
• 1.5.3 Leptin对妊娠的影响
• 1.5.4 Leptin对哺乳的影响
• 1.5.5 Leptin与禽类繁殖
• 1.6 Leptin与免疫
• 1.6.1 Leptin对免疫的作用
• 1.6.2 Leptin对禽类免疫的影响
• 1.7 Leptin的其他生物学功能
• 1.7.1 Leptin与心血管系统
• 1.7.2 Leptin与癌症的发生
• 1.7.3 Leptin与学习记忆
• 1.8 Leptin抵抗
• 1.8.1 外周性leptin抵抗
• 1.8.2 中枢性leptin抵抗
• 1.8.3 Leptin抵抗的治疗
• 1.9 本研究的目的和科学意义
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 药品与试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 常用溶液及培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 家鸭LEPR基因的克隆及后续实验
• 2.2.2 重组小鼠leptin对家鸭卵巢功能的影响
• 第3章 结果和分析
• 3.1 家鸭LEPR基因的克隆及后续研究
• 3.1.1 卵巢RNA的提取
• 3.1.2 家鸭LEPR基因的分段扩增
• 3.1.3 家鸭LEPR3'RACE和5'RACE扩增
• 3.1.4 家鸭LEPR基因序列拼接及分析
• 3.1.5 家鸭LEPR-b蛋白序列的系统分析
• 3.1.6 家鸭与其他物种LEPR-b的蛋白序列同源性分析
• 3.1.7 家鸭、鸡、小鼠和人的LEPR序列的蛋白序列结构比较
• 3.1.8 家鸭内参基因β-actin的扩增
• 3.1.9 家鸭体内LEPR基因表达的组织器官定位分析
• 3.1.10 家鸭LEPR片段的蛋白表达及切胶电洗脱纯化
• 3.1.11 家鸭LEPR多克隆抗体的制备及鉴定
• 3.2 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢功能的影响及其机制初步研究
• 3.2.1 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭的体重变化的影响
• 3.2.2 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭产蛋率的影响
• 3.2.3 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢解剖形态学变化的影响
• 3.2.4 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢影响的组织学研究
• 3.2.5 重组小鼠leptin对家鸭血清生殖相关激素的影响
• 3.2.6 家鸭各生殖相关蛋白基因的克隆及鉴定
• 3.2.7 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢生殖相关基因mRNA水平的影响
• 3.2.8 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢ER—B蛋白表达的影响
• 3.2.9 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢LEPR-b和LEPR-a表达的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 家鸭LEPR长短亚型的克隆及组织器官定位分析
• 4.2 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭生殖调控的影响
• 4.2.1 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭体重的影响
• 4.2.2 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢恢复的影响
• 4.2.3 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭生殖相关激素的影响
• 4.2.4 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢生殖相关基因表达的影响
• 4.2.5 重组小鼠leptin对禁食后恢复期家鸭卵巢LEPR-b和LEPR-a mRNA水平的影响
• 4.2.6 重组小鼠leptin调控禁食后恢复期家鸭卵巢功能恢复的可能机制
• 第5章 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 缩略词对照表
• 在学期间的成果
• 致谢