论文摘要
为探讨鸡大肠杆菌生物被膜的多重耐药机制并为其相关感染的防治提供理论依据,用双纸片协同法对从河南省各地分离出的27株鸡大肠杆菌分离株进行ESBLs的检测,用标准微量稀释法测定13种抗菌药对临床分离菌的抗菌活性,并用棋盘法检测克拉霉素+环丙沙星、克拉霉素+加替沙星、磷霉素+环丙沙星、磷霉素+加替沙星对浮游菌的抗菌作用;用改良的平板培养法制备生物被膜,用银染法鉴定,并用双纸片协同法检测其产ESBLs的情况,用紫外分光光度计测定ESBLs的活性,并和相应的浮游菌进行比较;用改良的CBD装置培养细菌生物被膜,用试管二倍稀释法检测抗菌药对生物被膜菌的抗菌活性,并用棋盘法检测克拉霉素+环丙沙星、克拉霉素+加替沙星、磷霉素+环丙沙星、磷霉素+加替沙星对被膜菌的作用效果,并和浮游菌作比较;通过观察克拉霉素和磷霉素对生物被膜形成的影响及对环丙沙星和加替沙星的增效作用并测定不同药物浓度组合对生物被膜最小生物被膜抑菌浓度（MBIC）来筛选药物组合;用筛选出的药物组合去清除制备好的成熟的细菌生物被膜,并观察作用效果。ESBLs检测结果表明,27株鸡大肠杆菌临床菌产ESBLs的有15株,不产ESBLs的有12株,ESBLs检出率为55.6%,相应的浮游菌制备成生物被膜菌后产ESBLs的有19株,不产ESBLs的有8株,ESBLs检出率为70.4%,其中有四株不产ESBLs的浮游菌在形成生物被膜菌后产生了ESBLs。ESBLs酶活性检测发现,浮游菌中ESBLs酶活性是（0.42±0.12）U/mg,而相应的生物被膜菌的酶活性是（0.71±0.23）U/mg,生物被膜菌ESBLs活性明显高于相应浮游菌ESBLs活性,是浮游菌的1.73倍。13种抗菌药对浮游菌抗菌活性测定结果表明,产ESBLs的菌株比不产ESBLs的菌株的耐药性明显提高,其中在大环内酯类药物中除了阿奇霉素外,产ESBLs和不产ESBLs菌株的耐药率均达100%,在喹诺酮类抗菌药中,加替沙星抗菌效果最好,产ESBLs菌的耐药率为8.3%,不产ESBLs菌的耐药率为0%。棋盘试验中,克拉霉素+环丙沙星、克拉霉素+加替沙星呈现无关和拮抗作用,没有相加和协同作用,磷霉素+环丙沙星、磷霉素+加替沙星呈相加或者协同作用;13种抗菌药对被膜菌抗菌活性测定结果表明,无论菌株是否产ESBLs酶,形成生物被膜菌后的耐药性均比相应的浮游菌增强了4～1024倍,且产酶菌相对于不产酶菌其耐药性增大的幅度要大。棋盘试验结果是克拉霉素+环丙沙星、克拉霉素+加替沙星呈现相加或协同作用,且以相加作用为主,磷霉素+环丙沙星、磷霉素+加替沙星呈相加或者协同作用。克拉霉素和磷霉素对BBF形成的影响试验中,用含0 MIC、1/4 MIC、1/16 MIC克拉霉素和磷霉素药液TSB培养7d后的生物被膜菌经银染法染色后,在显微照相系统下发现:经1/4、1/16 MIC药物处理后的生物被膜结构与0MIC处理组在结构上有明显不同,经药物处理的细菌7d后形成的生物被膜菌已经不再完整,而是细碎散在的、没有规则的结构,且这种差异表现为浓度相关性;克拉霉素和磷霉素对环丙沙星和加替沙星的增效试验中,经克拉霉素或磷霉素处理后,环丙沙星和加替沙星对大肠杆菌生物被膜的最低生物被膜清除浓度（MBEC）与空白对照相比均显著降低,表明克拉霉素和磷霉素对环丙沙星和加替沙星具有增效作用,但未表现出浓度依赖性。比较不同药物组合对生物被膜的MBEC得出加替沙星+克拉霉素、加替沙星+磷霉素的效果相对来说较环丙沙星+克拉霉素、环丙沙星+磷霉素好的结论。在药物组合的筛选试验中,分别测定了加:克（2:1～16:1）、加:磷（2:1～16:1）共8种药物组合对3株产ESBLs和3株不产ESBLs鸡大肠杆菌的MBIC值,经SPSS11.5统计分析确定了加:克（8:1）、加:磷（8:1）这两个组合。用筛选出来的药物组合去清除制备成熟的6株鸡大肠杆菌生物被膜菌,并观察不同时间的形态变化。结果是加:克（8:1）在10～18d,加:磷（8:1）在7～15d内有效地清除了6株致病性大肠杆菌的生物被膜。