FISH法研究内生细菌在植物体内的分布以及分布数量对植物感病的影响

论文摘要

本文选用实验室保存的植物内生细菌XG32、DLJ1、DP24和SZ2菌株作为试验对象,通过无菌苗系统以及荧光原位杂交方法研究了内生细菌在植物无菌苗体内的分布,同时初步探讨了内生细菌的分布对防治植物真菌病害的影响。根据内生细菌对几种真菌病害的拮抗性、ACC脱氨酶活性以及回接的内生性选出研究对象。其中XG32、DLJ1、DP24菌株对辣椒疫霉具有显著抑制效果,SZ2菌株对核盘菌的拮抗效果较强,四者均具有ACC脱氨酶活性,并均可在黄瓜无菌苗体内定殖。采用荧光原位杂交方法研究了XG32菌株在辣椒无菌苗及DP24菌株在黄瓜无菌苗体内的分布。首先,根据两种细菌的16S rRNA序列以及Genbank数据库,用BLAST、DNAclub软件和Oligo软件,分别设计并评估了若干特异性探针,筛选出特异性最强的探针进行试验,优化杂交条件并进一步验证其特异性。结果表明,菌株XG32的特异性探针为XG10,其杂交条件为杂交缓冲液中甲酰胺浓度为35%,NaCl浓度为1.2mol/L,杂交温度为42℃,清洗缓冲液中NaCl浓度为0.02mo1/L。DP24的特异性探针DP397,其杂交条件为杂交缓冲液中甲酰胺浓度为20%,NaCl浓度为0.9mo1/L,杂交温度为44℃,清洗缓冲液中NaCl浓度为0.02mol/L。通过与属内相近菌株及属外邻近菌株进行杂交试验,表明这两种探针均是特异的。将探针用Cy5进行红色荧光标记后,与接种细菌的植物组织进行荧光原位杂交试验。结果表明,荧光原位杂交与平板法试验结果基本相符,细菌的分布数量与分布部位均趋于一致,仅在菌量方面略少。植物内生细菌SZ2可以在黄瓜无菌苗内定殖,在根、茎、叶均有分布。植物无菌苗离体组织试验表明,其菌悬液可抑制核盘菌的侵染。将SZ2菌株接种至黄瓜无菌苗,进行植物离体组织抑菌试验,结果表明植物体内SZ2菌株对核盘菌的侵染有显著的抑制作用,与菌量成正相关。通过生理生化试验以及16S rDNA分子鉴定,确定SZ2菌株为Bacillus cereus。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 植物内生细菌的分布研究
• 1.1.1 植物内生细菌侵染植物过程研究
• 1.1.2 植物内生细菌定殖影响因子研究
• 1.1.3 检测植物内生细菌在植物体内分布的方法研究
• 1.2 荧光原位杂交技术在检测细菌分布方面的应用
• 1.2.1 荧光原位杂交技术的原理
• 1.2.2 荧光原位杂交探针设计方法
• 1.2.3 荧光原位杂交法常用探针
• 1.2.4 荧光原位杂交检测内生细菌分布
• 1.2.5 荧光原位杂交方法具有的优点
• 1.2.6 荧光原位杂交技术存在的缺陷
• 1.3 试验设计
• 第2章 功能性植物内生细菌的选择
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物内生细菌
• 2.1.2 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 内生细菌拮抗性的测定
• 2.2.2 内生细菌ACC脱氨酶活性的测定
• 2.2.3 内生细菌在无菌苗体内的分布
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 内生细菌拮抗性的测定
• 2.3.2 内生细菌ACC脱氨酶活性的测定
• 2.3.3 内生菌株在无菌苗体内的分布
• 2.4 讨论
• 第3章 植物内生细菌16S rRNA寡核苷酸探针的设计及杂交条件优化和特异性验证
• 3.1 材料
• 3.1.1 FISH实验常用试剂仪器设备
• 3.1.2 仪器设备及软件
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌株特异性探针的设计及评估
• 3.2.2 载玻片的预处理
• 3.2.3 细菌菌体的固定
• 3.2.4 荧光原位杂交步骤
• 3.2.5 杂交条件优化
• 3.2.6 探针特异性验证
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 菌株XG32和DP24特异性探针的设计及评估
• 3.3.2 菌株XG32和DP24特异性探针杂交条件优化
• 3.3.3 菌株XG32和DP24探针特异性的验证
• 3.4 讨论
• 第4章 荧光原位杂交检测植物内生细菌在植物体内的分布
• 4.1 材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 无菌苗的制备及菌株的接种
• 4.2.2 荧光原位杂交检测XG32菌株和DP24菌株在无菌苗中的分布
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 荧光原位杂交检测XG32菌株在辣椒体内的分布
• 4.3.2 荧光原位杂交检测DP24菌株在黄瓜体内的分布
• 4.4 讨论
• 第5章 SZ2菌株在植物体内的分布对核盘菌致病性的影响
• 5.1 材料
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 SZ2菌悬液对接种核盘菌的黄瓜离体组织致病性的抑制
• 5.2.2 SZ2菌株的分布数量与核盘菌致病性的关系
• 5.2.3 SZ2菌株产生拮抗作用的部位
• 5.2.4 SZ2菌株的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 SZ2菌悬液对接种核盘菌的黄瓜离体组织致病性的抑制
• 5.3.2 SZ2菌株的分布数量与核盘菌致病性的关系
• 5.3.3 SZ2菌株产生拮抗作用的部位
• 5.3.4 SZ2菌株的鉴定
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及科研成果
• 致谢