利用噬菌体展示技术制备高致病性禽流感病毒（HPAIV）的单链抗体（ScFv）

论文摘要

H5N1亚型禽流感具有巨大的公共卫生威胁性,目前已有200多人感染该病毒,其中50%以上患者死亡。研发针对H5N1亚型禽流感病毒的治疗制剂是禽流感大流行防控计划的重点。本研究旨在构建可与H5亚型高致病性禽流感病毒特异性结合的单链可变区（Single-chain variable fragment, ScFv）抗体,以期为使用免疫制剂治疗H5亚型禽流感病毒感染积累数据。首先提取分泌抗H5亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA,以简并引物,经RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,用（Gly4Ser）3连接肽基因,经重叠延伸反应,在体外将VH和VL基因装配成单链可变区ScFv抗体基因,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建了表达抗H5亚型禽流感病毒的ScFv抗体载体;经辅助噬菌体超感染,构建了抗H5亚型禽流感病毒的ScFv抗体噬菌体抗体库。再以H5亚型流感病毒为抗原对抗体库进行淘选和富集,经过3轮“吸附——洗脱——扩增”的富集筛选,噬菌体—ELASA鉴定得到一个活性较高的与H5亚型流感病毒抗原结合的克隆pCANTAB5E-F。序列测定符合抗体可变区结构特点。将重组的ScFv转化大肠杆菌TG1, IPTG进行诱导表达,得到可溶性的单链抗体,用诱导表达的菌液作SDS-PAGE、Western blot和ELISA鉴定表明,pCANTAB5E-F在E. coli TG1得到正确表达,并且表达的ScFv抗体有较好的生物学活性。HI实验表明获得的重组ScFv抗体具有良好的HI活性,与母源单抗具有类似的生物活性。本研究获得了与H5亚型流感病毒结合特异性较高的ScFv抗体,并实现了可溶性表达,为进一步进行H5亚型流感病毒的治疗性抗体的研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 禽流感病毒研究进展
• 1.1 禽流感病毒（AIV）的病原及形态结构
• 1.2 禽流感病毒抵抗力
• 1.3 禽流感病毒分子生物学特性
• 1.4 禽流感病毒的遗传变异
• 1.5 禽流感的致病性
• 1.6 禽流感的诊断与防制
• 1.7 禽流感的危害及公共卫生意义
• 2 抗体的研究进展
• 2.1 抗体的结构及生物学特性
• 2.2 抗体的发展历程
• 2.3 基因工程抗体
• 2.4 基因工程抗体的人源化
• 2.5 小分子抗体
• 2.6 噬菌体展示技术原理及特点
• 2.7 我国基因工程抗体的研究现状
• 2.8 趋势及展望
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株、菌株及载体
• 1.2 主要试剂
• 1.3 溶液配制
• 1.4 引物
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 杂交瘤细胞总RNA 的提取
• 2.2 逆转录合成cDNA 第一条链
• 2.3 VH 和 VL 基因的扩增
• 2.4 VH/VL PCR 产物的回收与纯化
• 2.5 VH/VL PCR 产物的克隆和鉴定
• 2.6 ScFv 基因的扩增、组装和鉴定
• 2.7 ScFv 基因表达载体的构建
• 2.8 重组抗体得噬菌体表面展示
• 2.9 pCANTA85E-F单链抗体的分泌表达
• 2.10 重组抗体pCANTA85E-F的免疫学检测
• 第三章 结果
• 3.1 杂交瘤细胞总 RNA 的提取电泳
• 3.2 VH、VL 基因片段的扩增和鉴定
• 3.3 pMD18-T- VH/VL重组质粒的筛选和鉴定
• 3.4 全套ScFv 基因片段的拼接和PCR扩增鉴定
• 3.5 pCANTA85E－ScFv 的克隆
• 3.6 pCANTA85E－ScFv重组质粒的PCR和酶切鉴定
• 3.7 pCANTA85E－ScFv抗体库容量鉴定
• 3.8 噬菌体文库的淘洗
• 3.9 重组抗体可溶性表达产物的SDS-PAGE 和 Western blot分析
• 3.10 表达产物的ELISA分析
• 3.11 表达产物的 HI 分析
• 第四章 讨论
• 4.1 ScFv 分子的组装
• 4.2 linker 的设计
• 4.3 载体的构建
• 4.4 重组抗体的表达
• 4.5 影响容量的因素
• 4.6 富集和淘选
• 4.7 展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介