ppENK、S100A4及其甲基化在胰腺癌发病机制的研究

论文摘要

胰腺癌的恶性程度高，预后差，其5年生存率只有5％，由于胰腺癌症状隐匿，发现症状时大部分已处于晚期，且手术切除率低，内科药物治疗效果不理想。胰腺癌的发病机理不详，这给早期诊断以及进一步治疗带来很大困难，只有真正揭示胰腺癌发病的内在机制，才能寻找到有效的诊断及治疗方法。ppENK基因定位于8q23-24，含有四个外显子和三个内含子。作为神经肽介质基因，ppENK基因编码甲硫氨酸—脑啡肽，而甲硫氨酸—脑啡肽能够明显抑制胰腺癌的生长。S100A4基因最初来源于小鼠腺癌细胞株CSML100，其表达与肿瘤的转移潜能相关。S100A4基因属于S100家族，定位于染色体1q21，参与多种生物学行为，如肿瘤细胞的侵袭和转移等。DNA甲基化是基因转录的重要调控因素，其在肿瘤发生中的作用是近年来的研究热点，DNA甲基化的改变涉及多种肿瘤，因此，改变DNA甲基化可以为人类治疗肿瘤提供新的途径。本研究旨在探讨ppENK基因和S100A4基因甲基化与胰腺癌的相关性，并初步探讨去甲基化药物对胰腺癌细胞增殖及细胞周期、细胞凋亡等的影响。第一部分：胰腺癌组织S100A4与ppENK基因表达及甲基化与胰腺癌相关的临床研究以胰腺癌组织、正常胰腺组织为研究对象进行了以下研究：1．采用MSP方法分析ppENK基因在31例胰腺癌组织及正常胰腺组织中的甲基化状态；2．免疫组化方法检测32例胰腺癌组织标本中S100A4蛋白表达阳性比率；3．采用COBRA方法分析S100A4基因（+331）位点在31例胰腺癌组织及正常胰腺组织中的甲基化状态；4．Fisher’s Exact Test法比较：①ppENK基因与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性；②S100A4蛋白表达与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性；③（+331）位点低甲基化与S100A4蛋白表达的相关性，及与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性；④S100A4基因（+331）位点低甲基化与ppENK基因甲基化进行相关性分析。研究结果显示：1．在31例胰腺癌组织标本中，ppENK基因甲基化率为90.3％（28／31）而正常胰腺未表现甲基化，未发现ppENK基因甲基化与临床病理指标存在相关性；2．S100A4蛋白在胰腺癌组织中表达率为87.1％（27／32），在正常胰腺组织中不表达。S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关。肿瘤分化程度越低，表达阳性率越高；3．S100A4基因（+331）位点低甲基化率为71.0％（22／31），在正常胰腺癌组织中呈高甲基化，（+331）位点低甲基化与外周血CA19-9水平呈相关性；4．（+331）位点低甲基化与S100A4蛋白表达呈相关性；5．S100A4基因（+331）位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。小结：1与正常胰腺组织相比，ppENK基因在胰腺癌组织中存在较高的甲基化率（90.3％）；2．S100A4蛋白在胰腺癌组织中存在较高比率的表达（87.1％），在正常胰腺组织中不表达。该基因（+331）位点与正常胰腺组织相比，在胰腺癌组织中表现为低甲基化，其比率为71.0％，低甲基化与S100A4蛋白表达有相关性；3．S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关，肿瘤分化程度越低，表达阳性率越高；（+331）位点低甲基化与CA19-9水平呈相关性。而ppENK基因与临床病理指标无相关性；4．S100A4基因（+331）位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。第二部分：胰腺癌细胞株S100A4与ppENK基因表达及甲基化在胰腺癌发生发展中的作用以5株胰腺癌细胞株（SW1990、Panc-1、PC3、Aspc-1、Pupan-1）和正常胰腺为研究对象进行了以下研究：1．采用MSP方法分析5株胰腺癌细胞株ppENK基因甲基化状态，RT-PCR方法检测胰腺癌细胞株、正常胰腺组织ppENK基因mRNA表达；2．采用COBRA方法分析5株胰腺癌细胞株S100A4基因（+331）位点的甲基化状态；RT-PCR方法观察胰腺癌细胞株及正常胰腺组织S100A4基因mRNA的表达；3．采用MTT方法观察去甲基化药物5-aza-dC对胰腺癌细胞株（Panc-1、Aspc-1）细胞增殖的影响；4．PI染色经流式细胞仪检测去甲基化药物5-aza-dC对胰腺癌细胞株（Panc-1、Aspc-1）细胞凋亡、细胞周期的影响；5．MSP方法观察去甲基化药物5-aza-dC对Panc-1、Aspc-1细胞ppENK基因甲基化状态的影响，RT-PCR方法检测去甲基化药物5-aza-dC对Panc-1、Aspc-1细胞ppENK基因mRNA表达的影响。研究结果显示：1．ppENK基因在正常胰腺组织中表达，在5株胰腺癌细胞株中表达失活，但与正常胰腺组织相比，均表现甲基化；胰腺癌细胞株及正常胰腺ppENK基因表达与甲基化呈相关性；2．S100A4基因在正常胰腺组织中不表达，表现为高甲基化；在5株胰腺癌细胞株中表达，表现为低甲基化；胰腺癌细胞株及正常胰腺S100A4基因表达与低甲基化之间呈相关性；3．胰腺癌细胞株及正常胰腺ppENK基因甲基化与S100A4基因低甲基化之间呈相关性；4．MTT结果显示：5-aza-dC在0.6uM、0.8uM、1.0uM浓度下72h、96h、120h对Aspc-1、Panc-1细胞增殖均有不同程度抑制作用，其中Aspc-1细胞OD值以96小时1.0uM时最为显著（p＜0.05），Panc-1细胞以120小时1.0uM时最为显著（p＜0.05）；5．Panc-1与Aspc-1予5-aza-dC 1uM后经PI染色，Panc-1细胞治疗组和对照组细胞凋亡百分率平均值分别为31.57±6.76％和3.21±1.43％（p＜0.05）；而Aspc-1细胞分别为16.6±8.22％和3.82±1.71％（p＞0.05）；6．流式细胞仪检测显示，Panc-1细胞的静止期（G1期）细胞百分率显著增加，DNA合成期（S期）细胞百分率显著降低（p＜0.05），但Aspc-1细胞未出现明显的G1期停滞及S期减少（p＞0.05）；7．对Panc-1、Aspc-1予去甲基化药物5-aza-dC后可见ppENK基因表达，甲基化状态改变。小结1．ppENK基因正常胰腺组织中存在表达，在5株胰腺癌细胞株均无表达，5株胰腺癌细胞株ppENK基因均表现为甲基化，表达与甲基化呈相关性；2．S100A4基因在正常胰腺组织中不表达，在5株胰腺癌细胞株中均有表达，5株胰腺癌细胞株中，（+331）位点均表现为低甲基化，表达与低甲基化呈相关性；3．ppENK基因甲基化与S100A4基因低甲基化之间呈相关性；4．去甲基化药物可逆转ppENK基因表达、改变ppENK基因甲基化状态；应用去甲基化药物后可抑制胰腺癌细胞增殖，增加细胞凋亡和影响细胞周期。结论：从分子水平对胰腺癌组织与细胞株研究显示，甲基化引起的ppENK基因失活和S100A4基因激活是胰腺癌发生发展重要的环节，ppENK基因甲基化和S100A4低甲基化可能成为胰腺癌细胞区别正常胰腺细胞的分子事件，S100A4基因（+331）位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关，S100A4基因（+331）位点低甲基化与CA19-9水平呈相关性；ppENK基因甲基化状态的改变，可能抑制胰腺癌的生长，增加凋亡并影响细胞周期。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 总技术路线
• 第一部分 胰腺癌组织ppENK与S100A4表达及甲基化与胰腺癌相关的临床研究
• 前言
• 实验流程
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 胰腺癌细胞株ppENK与S100A4基因表达及甲基化在胰腺癌发生发展中的作用
• 前言
• 第一节 胰腺癌细胞株S100A4与ppENK基因表达及甲基化相关性研究
• 实验流程
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 第二节 去甲基化药物（5-aza-dC）对胰腺癌细胞株增殖、凋亡的影响
• 实验流程
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢