首页> 正文

烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析

2020-12-15阅读(204)

烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析

论文摘要

烟碱是烟草根系合成的次生代谢产物,是烟草特有的生物碱。打顶以后,烟株体内烟碱含量大量积累,然而对造成烟株体内烟碱含量升高的原因以及烟碱合成的调节机制并不清楚。打顶前后烟碱合成能力的巨大差异,是用来研究调控烟碱合成分子机制的最佳时期,通过筛选烟株打顶前、后根尖组织的差异表达的基因将有新的发现。植物中含有大量的转录因子基因,在调控植物生长发育和逆境胁迫应答中起重要作用。常见的转录因子家族有AP2/EREBP、bZIP、MYB、WRKY和NAC等。本研究以本实验室构建的SSH-cDNA文库中筛选出的NAC类转录因子EST序列为探针,电子克隆得到NtNAC-R1全长cDNA序列,对于研究调控烟碱生物合成的分子机制有重要意义。本实验主要结果如下:（1）荧光定量PCR验证SSH-cDNA文库差异基因EST序列打顶前后的表达模式,F-box、MYB、NAC、SAHH、ST1在打顶24h后表达水平上升,WRKY、AUXIN -induced mRNA在打顶24h后表达水平下降。（2）采用电子克隆和RT-PCR从烟草根尖组织克隆到NtNAC-R1。烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp,编码311个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。（3）组织特异性分析表明NtNAC-R1基因在根系中具有高水平表达。RT-PCR和Northern杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式分析表明该基因在烟株打顶后2—4 h表达水平下降,随后上升。（4）构建了重组表达载体pRSETB-NtNAC-R1,转化表达菌株大肠杆菌BL21系列菌株,成功表达目的蛋白,且目的蛋白以包涵体形式存在。（5）构建了NtNAC-R1基因的过量表达和反义抑制植物遗传转化载体,得到了该基因的反义抑制转基因植株。RT-PCR分析反义抑制转基因植株中烟碱合成相关基因PMT、ODC的表达模式表明这两个基因表达量下降。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • 1. 文献综述
  • 1.1 转录因子概况
  • 1.2 NAC 转录因子的研究概况
  • 1.2.1 NAC 转录因子简介
  • 1.2.2 NAC 转录因子的生物学功能
  • 1.2.2.1 调节植物生长发育
  • 1.2.2.2 应答生物和非生物胁迫
  • 1.2.3 NAC 转录因子的表达调控
  • 1.2.3.1 NAC 转录因子的转录水平调控
  • 1.2.3.2 转录后调控
  • 1.2.3.3 翻译后调控
  • 1.3 烟碱的生物合成
  • 1.4 影响烟碱合成的胁迫因素
  • 2. 引言
  • 3. 材料与方法
  • 3.1 材料、试剂与仪器
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 菌株、载体与主要试剂
  • 3.1.3 主要仪器
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 总RNA 的提取
  • 3.2.2 cDNA 第一链的制备
  • 3.2.3 实时荧光定量PCR 检测SSH 文库差异表达基因
  • 3.2.4 烟草NtNAC-R1 基因的克隆
  • 3.2.5 克隆载体pMD19-T-NtNAC-R1 的构建
  • 3.2.5.1 连接
  • 3.2.5.2 转化
  • 3.2.6 烟草NtNAC-R1 的序列分析
  • 3.2.7 烟草NtNAC-R1 的组织特异性表达分析
  • 3.2.8 烟株打顶后24 h 内根尖组织NtNAC-R1 的表达分析
  • 3.2.8.1 RT-PCR 检测
  • 3.2.8.2 Northern 杂交检测
  • 3.2.8.2.1 变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA（甲醛变性胶电泳）
  • 3.2.8.2.2 转膜和RNA 固定
  • 3.2.8.2.3 探针标记
  • 3.2.8.2.4 预杂交、杂交和显色
  • 3.2.9 原核表达载体pRSETB-NtNAC-R1 的构建
  • 3.2.10 NtNAC-R1 在大肠杆菌中的诱导表达
  • 3.2.11 正义和反义表达载体pROK2-NtNAC-R1 构建
  • 3.2.12 相应植物表达载体的农杆菌转化及PCR 鉴定
  • 3.2.13 转化烟草
  • 3.2.13.1 烟草无菌苗的准备
  • 3.2.13.2 转基因烟苗的获得
  • 3.2.14 转基因烟草分子检测
  • 3.2.14.1 烟草转化植株的PCR 检测
  • 3.2.14.2 RT-PCR 检测
  • 4. 结果与分析
  • 4.1 总RNA 质量的检测
  • 4.2 各候选基因相对表达量分析
  • 4.3 烟草NtNAC-R1 的克隆
  • 4.4 克隆载体pMD19-T-NtNAC-R1 的构建
  • 4.5 烟草NtNAC-R1 的序列分析
  • 4.6 烟草NtNAC-R1 的组织特异性表达分析
  • 4.7 NtNAC-R1 在烟株打顶后24h 内的表达谱分析
  • 4.8 原核表达载体pRSETB-NtNAC-R1 的构建
  • 4.9 NtNAC-R1 的原核表达
  • 4.10 正义和反义表达载体pROK2-NtNAC-R1 构建
  • 4.11 农杆菌PCR 检测
  • 4.12 转基因烟草的获得
  • 4.13 转基因烟草分子检测
  • 4.13.1 烟草转化植株的PCR 检测
  • 4.13.2 RT-PCR 检测
  • 5. 结论与讨论
  • 5.1 结论
  • 5.2 讨论
  • 参考文献
  • Abstract

    • 相关论文文献

    • [1].烟草公司财务管理存在的问题[J]. 中国农业会计 2019(09)
    • [2].关于全面无纸化核算管理在烟草行业的可行性探讨[J]. 财经界 2019(35)
    • [3].关于加强烟草行业人才队伍建设工作的探讨[J]. 中国市场 2020(07)
    • [4].烟草化学分析技术的应用及发展探讨[J]. 科技创新与应用 2020(07)
    • [5].烟草优质高效栽培关键技术的应用[J]. 种子科技 2020(02)
    • [6].长沙烟草：迈向高质量发展这一年——长沙烟草聚焦“六项重点工作”推动高质量发展综述[J]. 湖南烟草 2019(05)
    • [7].上海市初中生烟草认知对烟草易感性的影响[J]. 上海预防医学 2020(02)
    • [8].烟草行政管理的宏观调控职能及转变策略[J]. 智库时代 2020(13)
    • [9].烟草专卖行政执法监管风险问题探究[J]. 中外企业家 2020(11)
    • [10].烟草抗旱相关基因的研究进展[J]. 烟草科技 2020(03)
    • [11].烟草废弃物无害化研究与应用探讨[J]. 江西农业学报 2020(04)
    • [12].近代全球化过程中烟草在中国的传播及影响[J]. 求是学刊 2020(03)
    • [13].烟草有机生产与烟叶质量安全性探究[J]. 热带农业工程 2020(01)
    • [14].清至民国时期西藏禁止烟草问题研究[J]. 西藏大学学报(社会科学版) 2020(02)
    • [15].烟草种植评价方法及综合应用[J]. 湖北农机化 2020(10)
    • [16].新时期烟草经济增长的困境及其对策研究[J]. 现代商贸工业 2020(31)
    • [17].烟草化学分析技术的应用及发展[J]. 化工管理 2020(27)
    • [18].烟草缺钾症的诊断及治疗方法研究[J]. 种子科技 2020(18)
    • [19].烟草种植技术与田间管理分析[J]. 河南农业 2020(23)
    • [20].对烟草行业管理问题的探讨[J]. 现代农业研究 2020(10)
    • [21].烟草专卖政务服务“好差评”制度的研究与应用[J]. 现代商贸工业 2020(34)
    • [22].对县级烟草公司安全文化建设的思考[J]. 现代商业 2018(31)
    • [23].抓基层 强基础 优状态 实作为 努力推动长沙烟草高质量发展[J]. 湖南烟草 2019(01)
    • [24].关于烟草行业建立财务共享服务中心的思考和探索[J]. 财政监督 2019(21)
    • [25].烟草病虫害控制工作分析[J]. 南方农业 2018(08)
    • [26].台湾早期烟草发展与福建关系之初探[J]. 福建史志 2018(04)
    • [27].浅析许可证管理对促进烟草行业规范的作用[J]. 山西农经 2018(19)
    • [28].烟草水肥一体化发展现状与应用前景[J]. 现代农业科技 2016(19)
    • [29].我国烟草对外贸易的发展困境及对策建议[J]. 企业改革与管理 2017(02)
    • [30].浅析新时期烟草行业政治思想稳定工作创新[J]. 现代国企研究 2017(02)

    标签：;  ;  ;  ;  

    烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5