RGD多肽接枝聚/FK506、NGF缓释膜促进大鼠坐骨神经再生的实验研究

论文摘要

一、背景、目的及意义实验证明:神经生长因子（nerve growth factor,NGF）能够促进损伤的大鼠坐骨神经的再生和功能恢复。他克莫司（tacrolimus,FK506）是由链霉菌产生的大环内酯类抗生素,同时,它也是一种极强的免疫抑制剂,它的免疫抑制能力是环孢素的100倍,能抑制混合淋巴细胞反应、细胞毒性T细胞增殖、IL-2、IL-3和干扰素等白细胞源性可溶性介质的产生及IL-2受体的表达。但是,它也具有促进损伤的大鼠坐骨神经的再生和功能恢复,它们在促进损伤的周围神经再生和营养神经的功能方面的关系,Lyons W E等曾作过探索,他们发现PC12细胞的FK506结合蛋白（FK506-binding proteins,FKBPs）的含量可以被NGF上调,而且FK506能够提高PC12细胞对NGF的敏感性,使产生最大轴突再生效应的NGF的浓度减少20—50倍,然后他们运用抗NGF的抗体作用于鼠感觉神经节,发现可以显著减弱FK506的促进鼠感觉神经节轴突的再生效应。周围神经损伤后,远段神经及近段数个Ranvier氏结节发生华勒（Waller）氏变性,然后雪旺细胞增殖形成Bungner氏带,再生轴突再穿过此带向远处再生,因此雪旺细胞的增殖对神经再生起很重要的作用。杨俊等发现FK506可以促进雪旺细胞增殖和分泌NGF。吴志伟等也发现在FK506培养的人胚坐骨神经组织块中,雪旺细胞迁出组织块的时间、迁移的距离和雪旺细胞的活性明显优于对照组。Hanawa H等在动物实验中观察到0.1mg/kg/day,0.32 mg/kg/day和1.0mg/kg╱day三种不同剂量的FK506肌肉注射治疗自身免疫性心肌炎的,用药组的炎症浸润程度都比对照组轻,且FK506的免疫抑制作用呈剂量依赖关系,剂量越大,炎症浸润程度越轻。但是,吴志伟等发现在FK506培养的人胚坐骨神经组织块中,雪旺细胞迁出组织块的时间、迁移的距离和雪旺细胞的活性等方面,在0.1ug/ml、1 ug/ml和10 ug╱ml等浓度的FK506之间无明显差别。对FK506在免疫抑制作用方面表现出剂量依赖性,而在影响雪旺细胞的方面却没有这样,Gold BG等解释是免疫亲和素FK506结合蛋白—52而不是免疫亲和素FK506结合蛋白—12介导了FK506的神经营养作用,而FK506的免疫抑制作用是以FK506与FK506结合蛋白—12为基础,免疫抑制和神经营养是通过两条不同的信号传导通路介导的。Sarikcioglu L等在坐骨神经挤压伤的大鼠中,利用神经鞘内注入0.05 mg/kg/day的FK506,发现此剂量也有益于损伤神经的再生。这也证明FK506局部用药和全身用药一样都有益于损伤周围神经的再生,且可以减少用量。基于以上事实,我们拟利用RGD多肽接枝聚复合FK506和NGF制成缓释膜,使FK506能够局部缓慢释放,又利用FK506与NGF的协同作用,更好地发挥FK506的促神经生长作用,为临床上发挥FK506的促神经再生和营养作用,又尽可能减少它的免疫抑制效应提供一定的科学依据。二、方法1、将24只雄性Wistar大鼠随机分成3组,每组8只,A组:RGD多肽接枝聚复合FK506和NGF缓释膜组,B组:RGD多肽接枝聚复合FK506缓释膜组,C组:RGD多肽接枝聚膜组。2、0.4%的戊巴比妥钠,1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠。暴露左侧坐骨神经,切断,分别以对应的膜桥接。将坐骨神经置于膜中间,暂时将神经外膜各固定一针于膜的两端,剪断坐骨神经,任其回缩形成5mm缺损,然后将膜缝制成管状。A组膜FK506与NGF的含量分别为0.48mg和2ug,B组膜FK506的含量为0.72mg,C组对照组。3、术后3个月,暴露出双侧小腿三头肌及复合膜桥接处的再生神经,观察实验测三头肌的情况和再生神经的粗细、复合膜质地、吸收及与周围组织粘连情况,然后将刺激电极置于导管近端的神经干上,记录电极插入小腿三头肌,采用丹麦产的诱发电位/肌电图监测仪4000型,测量坐骨神经的运动传导速度（MNCV）、复合肌肉动作电位（CMAP）和潜伏期。4、神经电生理检测完毕,快速切下再生的神经置入2.5%的戊二醛固定;接着完整切下双侧小腿三头肌,实验测与健侧作比计算实验测小腿三头肌的恢复恢复率。5、术后3个月,取复合膜远端的再生神经,用2.5%戊二醛固定2h以上,1%锇酸后固定1h,Epon812树脂定向包埋,半薄切片厚1.0微米,亚甲基蓝多色染液染色,在光镜下观察并记录神经生长的情况。图像分析采用HPIAS—1000彩色病理图文报告分析系统,测定再生神经中有髓神经纤维的数目、髓鞘厚度和轴突直径,对再生神经进行形态学分析。6、术后3个月,取复合膜远端的再生神经,用2.5%戊二醛固定2h以上,1%锇酸后固定1h,Epon812树脂定向包埋,超薄切片厚60nm,醋酸双氧铀-枸橼酸铅染液染色,在电镜下观察神经髓鞘及轴突的情况。7、实验数据采用统计软件SPSS11.5处理,数据均以（?）±s表示,差异以单因素方差分析,两组间均数比较用LSD法和S-N-K法。（α=0.05）三、结果1、大体观察:术后14天左右A组有2只足部出现溃疡,B组有1只出现溃疡,C组1只出现溃疡,均于1周后愈合;小腿三头肌均有不同程度萎缩,A组萎缩程度较B、C组轻:膜外形完整,但变软易碎,与周围组织无明显粘连;再生神经通过缺损,A组较粗,粗细与近端神经无明显差别。2、电生理检测:术后3个月,各组MNCV、CMAP波幅及潜伏期的检测结果（表1）。A组的MNCV大于B组,差异有统计学意义（P=0.016）,A组的MNCV大于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组大于C组,差异有统计学意义（P=0.030）;A组的CMAP高于B组,差异有统计学意义（P=0.049）,A组的CMAP高于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组高于C组,差异有统计学意义（P=0.046）;A组的潜伏期小于B组,差异有统计学意义（P=0.046）,A组的潜伏期小于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组潜伏期小于C组,差异有统计学意义（P=0.049）。3、三头肌湿重恢复率检测:术后3个月,小腿三头肌湿重的恢复率（表2）,A组大于B组,差异有统计学意义（P=0.050）;A组大于C组,差异有统计学意义（P=0.000）;B组大于C组,差异有统计学意义（P=0.044）。4、光镜观察:术后3个月,A组再生神经亚甲基蓝多色染液染色,见神经纤维密集、髓鞘厚,较大的神经纤维多、神经纤维大小差别小、能看到雪旺细胞胞质区的情况少;B组再生的神经纤维较稀疏、髓鞘较薄,较大的神经纤维少、神经纤维大小差别大、能看到雪旺细胞胞质区的情况较多;C组再生的神经纤维很稀疏、髓鞘亦薄,较大的神经纤维很少、神经纤维大小差别大、能看到雪旺细胞胞质区的情况多。5、图像分析:术后3个月,A组的有髓神经纤维计数多于B组,差异有统计学意义（P=0.041）,A组的有髓神经纤维计数多于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组的有髓神经纤维计数多于C组,差异有统计学意义（P=0.001）;A组的轴突直径大于B组,差异有统计学意义（P=0.034）,A组的轴突直径大于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组大于C组,差异有统计学意义（P=0.042）;A组的髓鞘厚于B组,差异有统计学意义（P=0.046）,A组的髓鞘厚于C组,差异有统计学意义（P=0.000）,B组髓鞘厚于C组,差异有统计学意义（P=0.016）。6、电镜观察:术后3个月,透射电镜结果显示:A组再生有髓纤维多,髓鞘完整,髓鞘形态好,且比B组和C组厚,C组最差,再生的有髓纤维少,排列较稀疏。四、结论FK506和NGF复合膜能有效地促进损伤的鼠坐骨神经的再生,而且FK506和NGF联合应用,可以减少免疫抑制剂FK506的用量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 RGD多肽接枝聚/FK506、NGF缓释膜促进大鼠坐骨神经再生的实验研究
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 1.5 参考文献
• 1.6 附图及附表
• 第2章 神经生长因子（NGF）、他克莫司（FK506）促进周围神经生长的作用
• 2.1 神经生长因子（NGF）促进周围神经生长的作用
• 2.2 他克莫司（FK506）促进周围神经生长的作用
• 2.3 FK506促进周围神经生长的作用的剂量及与NGF的关系
• 2.4 参考文献
• 第3章 成果
• 第4章 致谢