论文摘要
阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease, AD）是以进行性学习记忆和认知功能障碍为特征,最终导致患者生活能力丧失的一种老年性神经退行性疾病。该病严重损害老年人的身心健康,已成为致人类死亡的第四大疾病,同时也是影响家庭和社会发展的重要制约因素之一。AD依据有无遗传史可分为家族性和散发性,其典型的神经病理学特征是淀粉样蛋白（amyloidβ-peptide,Aβ）斑和tau蛋白沉积形成的神经原纤维缠结。尽管已发现有3种基因的突变可以引起稀有的家族性遗传AD,但大多数AD病人（90–95%）属于非遗传性的散发性迟发性AD （≥65岁） （late-onset AD,LOAD）,病因至今仍不清楚。流行病学调查结果证明,应激是AD的危险因素,发生心理不良应激的老年人比同年龄人更易于发生AD,丰富的环境可以降低Aβ水平和蛋白斑形成。目前认为,散发性AD的发生是多种不同的遗传和环境因素共同作用的结果。因此,深入研究AD的发病原因与机理,特别是研究遗传以外的环境因素如何影响散发性AD的发病,将在防治AD、维护老年人健康方面起到积极的作用,具有极其重要的理论和实际意义。在众多的环境因素中,应激等精神心理因素如抑郁、焦虑等在神经退行性疾病发病中的作用日益受到重视。应激反应的基础是体内一系列神经-内分泌-免疫网络系统反应,应激相关的神经内分泌激素很可能是AD发生发展过程中重要的因素。糖皮质激素（Glucocorticoids,GC）属于类固醇激素,容易穿过血脑屏障结合糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptors, GR）。现已证实, GC对于中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的许多功能,包括学习和记忆都非常重要,但在应激中产生的过量GC会损害认知功能。GC对应激刺激的反应受下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic–Pituitary–Adrenal,HPA）轴的调控,由肾上腺皮质释放GC（灵长类是皮质醇,啮齿类是皮质酮）。流行病学调查表明AD病人中HPA轴功能失调,表现为循环水平的皮质醇水平显著升高。因此,GC作为应激反应中重要的神经内分泌激素很可能参与AD的发生发展。在AD发病机理的研究方面,目前大多数学者都认为,大脑Aβ的代谢异常——包括过度产生或降解减少,引起Aβ聚合沉积形成β淀粉样蛋白斑在AD的发生发展中起关键作用。Aβ是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）被β分泌酶（APP的β位点裂解酶,β-site APP cleaving enzyme,BACE）和γ分泌酶相继裂解的产物。以往对AD发病中Aβ代谢异常的研究主要集中于大脑的神经元,实验发现,GC可通过影响神经元Aβ代谢,从而对AD的发生发展起一定的促进作用。近年来,星形胶质细胞在AD发病中的重要作用越来越受到关注。研究表明,星形胶质细胞具有分泌和降解清除Aβ的双重功能。一方面,在对转基因AD小鼠和AD病人的研究中发现,星形胶质细胞来源的Aβ参与蛋白斑形成和成熟,只是在时相上晚于神经元。另一方面,对老年AD病人大脑的尸检分析,常可观察到Aβ斑块周围存在大量的星形胶质细胞,进一步的实验证实增生和活化的星形胶质细胞可以吞噬和降解Aβ。有资料显示:GC能调控星形胶质细胞的增殖、分化过程以及细胞因子的分泌,是神经退行性疾病中影响星形胶质细胞代谢的关键激素。但迄今为止,有关GC是否影响星形胶质细胞Aβ的代谢过程,参与AD的发病尚未见报道。在本研究中,我们使用应激浓度的GC,通过体内外实验研究GC对星形胶质细胞Aβ代谢的效应和机制,以及对AD病理的影响。期望从星形胶质细胞调控Aβ代谢的新角度认识GC在AD发生发展中的作用,为深入理解散发性AD的发病机制提供新的理论依据,并为寻找有效防治靶点提供线索。本文的主要研究内容及结果包括:1.证实了GC能够促进星形胶质细胞生成Aβ。建立了体外GC刺激星形胶质细胞分泌Aβ的模型:利用AdEASY腺病毒系统在293细胞成功表达了含APPSW突变型和APP野生型的腺病毒,用腺病毒感染原代星形胶质细胞后,加入地塞米松或者皮质酮检测对Aβ分泌的影响。结果显示,在未受刺激的条件下,星形胶质细胞基本不分泌Aβ,糖皮质激素可以促进星形胶质细胞分泌Aβ,并且和刺激剂量及时间呈正相关关系。2.明确了GC促进星形胶质细胞生成Aβ的效应通路。首先,检测了GC发挥作用是通过GC的基因组效应还是非基因组效应实现的。结果发现,用不可穿过胞膜的BSA偶联的皮质酮刺激星形胶质细胞无促进Aβ分泌的作用,说明GC的效应是通过基因组效应实现的。其次,检测了GC发挥基因组效应的受体通路。结果显示,GR的拮抗剂米非司酮（mifepristone,RU 38486）可以完全阻断GC促进星形胶质细胞分泌Aβ的作用,相反盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor,MR）的拮抗剂安体舒通（spironolactone,RU 28318）对GC该效应没有明显抑制,进一步说明GC促进星形胶质细胞分泌Aβ是由结合GR后核转位介导的基因组效应介导的。3.探讨了GC促进星形胶质细胞生成Aβ的分子机制。用定量RT-PCR和Western blotting检测了地塞米松或者皮质酮处理星形胶质细胞后APP和BACE的表达变化。结果显示,星形胶质细胞中APP和BACE的mRNA和蛋白表达均升高,由BACE剪切APP产生的Aβ的前体蛋白C99的含量也升高。说明GC促进星形胶质细胞中APP和BACE的表达升高可能是引起Aβ分泌增加的原因。4.发现了GC能够抑制星形胶质细胞吞噬和降解Aβ。在体外培养的成年星形胶质细胞上,加入地塞米松后用激光共聚焦检测对Aβ1–42吞噬和降解的影响。结果显示,GC明显抑制星形胶质细胞吞噬和降解Aβ1–42的效率;而加入GR拮抗剂RU 38486几乎抵消了GC的效果,而MR拮抗剂RU 28318没有明显影响GC的效果。结果提示GC能够抑制星形胶质细胞吞噬和降解Aβ1–42,其效果是依赖于GR的。5.体内实验进一步明确了GC影响星形胶质细胞Aβ代谢在AD病理中的作用。分别选取5月龄和12月龄的正常和转基因AD小鼠,连续腹腔注射10 d地塞米松,并设立RU 38486拮抗组,观察GC对星形胶质细胞数量、APP及BACE表达和Aβ斑块形成的效应。结果发现:注射GC可以增加皮层和海马区星形胶质细胞数量,并且在AD小鼠中,大量星形胶质细胞包绕于蛋白斑周围。GC增加了Aβ斑块,证实了GC对体内Aβ病理的促进作用。而星形胶质细胞中APP和BACE表达明显升高,提示GC通过增加这二者的表达增加Aβ的分泌,可能是促进蛋白斑形成引起AD病理的机制之一。综上,本研究首次发现GC可以影响星形胶质细胞的Aβ代谢,增加Aβ生成同时抑制其降解。我们的研究结果提示GC通过作用于星形胶质细胞促进蛋白斑形成,参与AD病理的发生发展。这一发现的意义在于不仅更加明确了GC作为重要的神经内分泌激素可引起和加重AD病变,是AD发生的危险因素,而且让我们从作用于星形胶质细胞的新途径认识了导致AD病理的机制。