水稻根部静止中心和干细胞的特化研究

论文摘要

根是植物的重要器官,对于植物的营养吸收、生长发育及抗逆境胁迫等生命活动极为重要。植物根部静止中心（quiescent center; QC）和干细胞对于植物根系的形态建成和生长发育起着决定性作用,因此对于植物根部QC和干细胞的特化研究是了解植物根系生长发育过程的基本途径。在拟南芥中,根部干细胞持续自我更新并分化产生各种根部发育需要的子细胞,PLT基因作为维持根部QC特异性以及干细胞活性的基因,对于根部形成发育具有极其重要的作用和影响。与拟南芥相比,水稻根部干细胞小生境的相关研究非常不足。作为我国的重要经济作物,研究水稻根部QC和干细胞的特化相关基因会对水稻的品质改良起到巨大推动作用。本研究以水稻为材料,以拟南芥PLT基因（AtPLT）的研究成果为依据,采用反向遗传学和正向遗传学同时进行的研究策略,利用分子生物学、遗传学、发育生物学等研究手段,配合现代生物信息学方法,对水稻根部干细胞小生境的相关基因进行研究。旨在探索根部形态建成和干细胞小生境特化的重要基因在水稻中的表达和功能。研究成果有望应用于水稻品种的根系改良,提高水稻生产效率。目前获得的主要研究结果如下：1)生物信息学分析：对4个AtPLTs和预测的12个水稻PLT （OsPLT）转录因子进行蛋白序列同源性分析、进化树分析,基因芯片表达谱分析和共表达分析。蛋白质同源性分析结果显示水稻PLT基因家族与AtPLTs同源性高,均具有2个正向重复的AP2功能域的蛋白编码序列。进化树分析结果表明OsPLT2、OsPLT12和OsPLT9之间的蛋白序列同源性极高。两个芯片数据库的表达谱分析结果显示12个OsPLTs中,OsPLT3、OsPLT7和OsPLT9在水稻根部的的表达水平较其他水稻PLT基因高。基因共表达结果说明OsPLT7与其他水稻PLT基因的共表达次数最高（4次）,OsPLT3和OsPLT9的共表达次数其次（各3次）。2)水稻PLT基因表达的研究：本研究构建了水稻PLT家族中OsPLT7和OsPLTll的启动子报告基因融合载体,并已成功转化水稻。通过对这些具有启动子报告基因融合载体的水稻后代进行GUS染色和微分干涉显微观察,发现OsPLT7和OsPLT11特异的在水稻根部QC细胞和干细胞小生境部位表达,与其拟南芥同源基因的表达谱非常类似。3)筛选水稻根部干细胞相关基因：本研究利用正向遗传学方法,对华中农业大学国家植物基因研究中心建立的水稻T-DNA插入突变体库进行筛选。通过GUS染色、体式显微镜和微分干涉显微镜观察、树脂切片观察、侧翼序列分离等实验方法,得到GUS表达模式稳定的水稻家系24个,通过分析部分可能与水稻QC和干细胞特化相关的家系并分离其侧翼序列,得到候选基因3个。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 水稻根系的形态与结构
• 1.2 水稻根系与拟南芥根系的比较
• 1.3 根部干细胞小生境的功能及研究进展
• 1.3.1 根部干细胞小生境的功能
• 1.3.2 根部干细胞小生境的研究进展
• 1.4 PLT基因的研究进展
• 1.5 T-DNA插入突变体库的研究进展
• 1.5.1 T-DNA插入突变体库
• 1.5.2 分离侧翼序列的方法
• 1.5.2.1 接头PCR
• 1.5.2.2 反向PCR
• 1.6 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 试验试剂
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 生物信息学分析
• 2.2.1.1 水稻同源PLT基因的预测
• 2.2.1.2 水稻PLT基因的蛋白质同源性分析和进化树分析
• 2.2.1.3 水稻PLT基因的芯片数据分析
• 2.2.1.4 侧翼序列分离出候选基因的生物信息学分析
• 2.2.2 水稻种子的灭菌培养与观察
• 2.2.2.1 次氯酸钠灭菌法
• 2.2.2.2 GUS染色观察
• 2.2.2.3 水稻根部树脂切片观察
• 2.2.3 水稻PLT启动子报告基因融合载体的构建
• 2.2.3.1 PLT启动子序列的克隆
• 2.2.3.2 载体转化水稻
• 2.2.4 转化苗PCR阳性检测
• 2.2.5 分离侧翼序列
• 2.2.5.1 接头PCR
• 2.2.5.2 反向PCR
• 3. 结果与分析
• 3.1 生物信息学分析
• 3.1.1 PLT基因家族编码蛋白的同源性分析
• 3.1.2 水稻PLT基因的芯片数据分析
• 3.2 反向遗传学方法对水稻PLT基因的研究
• 3.2.1 OsPLT启动子报告基因融合载体的构建
• 3.2.2 转化苗阳性检测
• 3.2.3 阳性转化苗GUS染色观察
• 3.3 正向遗传学方法对水稻根部干细胞相关基因的研究
• 3.3.1 筛选水稻T-DNA插入突变体库
• 3.3.2 水稻根尖干细胞小生境特异表达植株的观察及分析
• 3.3.3 候选基因的分析
• 4. 讨论
• 4.1 研究方法
• 4.2 水稻PLT基因功能的研究
• 4.3 水稻T-DNA插入突变体库的筛选
• 4.4 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢