RNAi技术沉默AcMNPVp35基因的初步研究

论文摘要

RNA沉默（RNA-Silencing）包括动物RNA干扰（RNA interference，RNAi）、真菌的抑制（quelling）、植物中的转录后基因沉默（posttranscriptional gene Silencing，PTGS）和协同抑制（cosuppression）等，是一种基于靶序列特异性和RNA降解的基因表达调节机制，在真核生物免疫外源遗传因子（转座子、转基因或病毒）和调节r内源基因表达的过程中起着重要作用。RNA沉默的效应物是核酸，无论外源exogenous或内源的核酸在体内都转变为21-27nt的小RNA（small RNA）信号分子来指导RNA沉默。这些小RNA包括微小RNA（microRNh，miRNA）、干扰性小RNA（small interfering RNA，siRNA）和重复相关干扰RNA（repeat-associated small interfering RNA，rasiRNA），小RNA分子指导RNA沉默效应（effector）复合物（如RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced Silencing complex，RISC）、转录后基因沉默复合体（RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing，RITS））的装配，最后，含有小RNA的效应复合物使目的基因的mRNA发生转录水平或转录后的沉默。研究发现AcMNPV的p35基因具有抗凋亡anti-apoptosis特性，缺失knock down AcMNPV中的p35基因将引起induce AcMNPV感染的细胞凋亡。本文将p35基因的部分序列构建到pLITMUS28i质粒中，重组载体pLITMUS-p35在体外转录褪火形成dsRNA。当dsRNA导入到AcMNPV感染的sf9细胞后，我们没有观察到很明显的细胞凋亡现象，原因可能为我们质脂体的转染效率不高。因此我们还需要不断地摸索RNAi技术。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 RNA沉默简介
• 1.1.1 RNA沉默的发现与发展
• 1.1.2 RNA沉默的机制
• 1.2 siRNA的合成
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 体外转录合成法
• 1.2.3 siRNA表达载体在细胞中表达siRNA
• 1.2.4 siRNA表达框架在细胞中表达siRNA
• 1.3 RNAi技术的应用
• 1.4 本实验的研究背景与目的
• Ⅱ 实验材料
• 2.1 供试病毒、菌株、质粒及细胞系
• 2.2 实验所用试剂
• 2.2.1 细菌培养培养基
• 2.2.2 细胞培养基
• 2.2.3 寡核苷酸引物
• 2.2.4 酶及其它常规试剂
• 2.2.5 常用溶液及配制
• Ⅲ 实验方法
• 3.1 病毒的扩增
• 3.2 含AcMNPV p35基因的Ac Bacmid DNA的制备
• 3.3 AcMNPVp35基因片段的扩增与纯化回收
• 3.3.1 PCR反应体系
• 3.3.2 PCR反应热循环程序
• 3.3.3 PCR产物的回收与纯化
• 3.4 重组pLITMUS-p35的制备
• 3.4.1 pLITMUS28i质粒的制备
• 3.4.2 双酶切质粒pLITMUS28i DNA
• 3.4.3 pLITMUS-p35的构建
• 3.4.4 阳性克隆的筛选与鉴定
• 3.5 脂质体转染效率的检测。
• 3.6 dsRNA的体外转录
• 3.7 dsRNA转染AcMNPV感染的sf9细胞
• 3.8 细胞凋亡的DAPI检测
• Ⅳ 实验结果分析及其讨论
• 4.1 实验结果及分析
• 4.1.1 AcMNPVp35基因片段的克隆及鉴定
• 4.1.2 AcMNPVp35基因片段dsRNA的体外制备
• 4.1.3 脂质体转染效率的检测
• 4.1.4 dsRNA转染AcMNPV感染的sf9细胞
• 4.2 结果讨论
• 参考文献
• 致谢