黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

论文摘要

黄瓜是国内外广泛种植的一类重要蔬菜作物,在蔬菜周年化供应中具有重要作用,实际生产栽培中常因各种病虫的危害造成巨大的经济损失。由于传统病虫害防治方法的种种不利因素,因此,选育抗性品种从根本上提高黄瓜抗病虫能力,是防治的最佳途径。但是黄瓜种内抗性材料缺乏,传统育种很难获得突破。本研究以不同材料的黄瓜子叶、子叶节作外植体,研究了基因型、激素对黄瓜离体分化的影响,建立了高效的离体再生体系;同时研究了AS、侵染时间、PH值对黄瓜遗传转化的影响,优化了转化体系;在此基础之上,通过根癌农杆菌介导法,将GUS基因导入黄瓜,对转化体系进行了初步探索,并进一步将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,为黄瓜遗传转化的相关研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.基因型是植物离体再生能力高低的重要影响因素之一,不同基因型之间的再生能力差异很大。黄瓜子叶再生体系建立所用的6份材料（中农8号、吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、Gy14、65G、9110Gt）中,华南类型材料吉林旱瓜的再生能力最强,在培养基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3上,再生频率和每外植体再生芽数分别为96.7 %和5.2;黄瓜子叶节再生体系的建立所用的8份材料（吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、0513、228、Gy14、65G、185、K2148）之中,华南类型材料四川白瓜的再生能力最强,在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3上,再生频率和每外植体再生芽数分别为100 %和6.4。2.植物激素是植物离体再生所必需,6-BA是黄瓜离体分化中最常用的植物激素之一。对于黄瓜子叶外植体的分化而言,6-BA是不定芽发生的主导因素,而ABA的添加能显著提高不定芽数目。美国加工类型材料Gy14和欧洲华北混合类型材料9110Gt的最佳诱芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3;华南类型材料吉林旱瓜和四川白瓜的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3;欧洲温室类型材料65G的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3;华北类型中农8号最佳诱芽培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3。对于黄瓜子叶节外植体的分化而言,培养基中仅附加6-BA即可得到很好的再生效果,不同材料对激素的敏感程度不同。材料228、185、65G的最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3;材料四川白瓜、吉林旱瓜、K2148、0513的最佳幼芽培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3;GY14的最佳幼芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3。3.在黄瓜再生体系建立的基础之上,研究了子叶节对Km和Hyg的耐受性和敏感度,确定了含不同抗性基因载体的筛选剂浓度,Km的选择压为75 mg/L,Hyg的选择压浓度为10 mg/L。4.黄瓜遗传转化体系优化的结果表明,在预培养基、菌液、共培养基中添加AS能显著提高抗性芽数量,最佳浓度分别为250 ul/L、500 ul/L、250 ul/L;侵染时间为15 min时,外植体再生频率和抗性芽数最高;选择培养基pH较低时有利于外植体分化,以PH=5.40最佳。5.采用根癌农杆菌介导法将GUS基因转化黄瓜,对转化体系作初步探索。得到了Km抗性植株,取幼嫩叶片,经GUS组织化学染色,共有14株显示蓝色,表明GUS基因已整合到黄瓜基因组,并实现表达,初步统计阳性率为7.4 %。6.在遗传转化体系的优化和探索的基础之上,将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,筛选获得了Hyg抗性植株。提取抗性植株的基因组DNA,经PCR检测,共有28株扩增出500 bp左右的特异条带,初步统计阳性率为5.3 %,为黄瓜的抗线虫病育种提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄瓜离体培养研究进展
• 1.1.1 植物离体再生途径
• 1.1.2 黄瓜离体培养的影响因素
• 1.2 黄瓜遗传转化研究进展
• 1.2.1 遗传转化的方法
• 1.2.2 黄瓜遗传转化研究现状
• 1.3 黄瓜遗传转化存在问题与展望
• 1.3.1 黄瓜离体再生存在的问题
• 1.3.2 黄瓜遗传转化存在的问题
• 1.3.3 黄瓜遗传转化前景展望
• 1.4 研究目的与意义
• 第二章 黄瓜离体再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 激素对黄瓜离体再生的影响
• 2.2.2 基因型对黄瓜离体再生的影响
• 2.2.3 6-BA 对不定芽伸长的影响
• 2.2.4 再生植株的生根
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 黄瓜遗传转化体系的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 卡那霉素（Km）对外植体分化的影响
• 3.2.2 预培养基中附加AS 对抗性芽再生的影响
• 3.2.3 菌液中附加AS 对抗性芽再生的影响
• 3.2.4 侵染时间对抗性芽再生的影响
• 3.2.5 共培养基中附加AS 对抗性芽再生的影响
• 3.2.6 选择培养基PH 对抗性芽再生的影响
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 黄瓜遗传转化体系的初步探索和抗线虫基因MiMPK1 的转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 潮霉素（Hyg）对外植体分化的影响
• 4.2.2 抗性植株的获得
• 4.2.3 基因组DNA 质量检测
• 4.2.4 GUS 染色结果
• 4.2.5 PCR 检测结果
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历