siRNA干扰Mcl-1表达对胃癌细胞生物学行为的影响

论文摘要

目的探讨siRNA干扰Mcl--1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法利用R T-PCR检测MCl-1基因在胃癌细胞株SGC7901和MGC-803中的表达；化学合成四对Mcl-1siRNA,分别标记为Mcl-1siRNA1、Mcl-1siRNA2、 Mcl-1siRNA3和Mcl-1siRNA4,利用脂质体Lipofectamine2000瞬时转染胃癌细胞SGC7901和MGC-803。采用标记有荧光的阴性对照siRNA在荧光显微镜下检测转染效率；转染24h,48h,72h后,通过实时定量PCR和Western blot分别检测Mcl-1mRNA和蛋白的表达,筛选出干扰效果最好的siRNA片段；用抑制率最高的siRNA及无义阴性对照再次转染胃癌细胞SGC7901和MGC-803,设立脂质体对照和空白对照。MTT法检测MCl-1抑制前后细胞增殖情况；转染48h后收集细胞,分别进行AnnexinV-FITC口PI双染,观察细胞各组凋亡变化情况；PI单染,观察各组细胞周期变化情况；转染48h后应用Transwell小室及Matrigel胶,通过计数细胞数目分析细胞侵袭迁移能力的变化。结果1.胃癌细胞株SGC7901和MGC-803均存在Mc1-1基因的表达。2.按照脂质体说明书推荐的比例转染胃癌细胞,转染效率约为80%。3.用实时荧光定量PCR法和Western blot方法分别检测转染24h、48h、72h后MCl-1基因mRNA和蛋白的表达情况。结果显示,转染24h、48h后两株细胞MCl-1基因mRNA相对表达量在MCl-1siRNA片段转染组中与各对照组中比较差异显著（P<0.05）。而转染72h后,在SGC7901细胞中,只有Mcl-1siRNA1、Mcl-1siRNA2、Mcl-1siRNA3组跟各对照组比较差异显著（P<0.05）,siRNA4组跟各对照组比较差异无明显差异（P>0.05）;在MGC-803细胞中,只有Mcl-1siRNA1、Mcl-1siRNA3组跟各对照组比较有显著差异（P<0.05）,siRNA2、siRNA4组跟各对照组比较无明显差异（P>0.05）。两株细胞各个时间点中,空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组之间比较差异均不显著（P>0.05）。四个片段中Mcl-1siRNA1的抑制作用最好,转染24h、48h、72h后的抑制率在SGC7901中分别为79.4%、73.8%、66.1%。而在MGC-803中分别为51.9%、67.6%、63.1%。蛋白表达水平的检测结果显示,SGC7901细胞中,转染24h、48h、72h后各转染Mcl-1siRNA组与各对照组比较,MCl-1蛋白表达显著下调（P<0.05）。不同片段之间比较,24h、48h时Mcl-1siRNA2抑制率最高,分别达到99.7%和82.2%,而72h抑制率最好的为siRNA3,达到57.3%。通过对不同时间点抑制率的观察发现,Mcl-1siRNA1和Mcl-1siRNA3组在48h的抑制效果最好分别为79.3%和64.0%,而Mcl-1siRNA2和Mcl-1siRNA4组则在24h时抑制效果最好,分别为99.7%和55.8%。在MGC-803细胞中,转染24h后,只有Mcl-1siRNA1组与各对照组细胞比较,Mc1-1蛋白的表达显著下调（P<0.05）。而Mc1-1siRNA2组、Mcl-1siRNA3组、Mcl-1siRNA4组与各对照组之间比较无明显差异性（P>0.05）。转染48h后,Mcl-1siRNA1组、Mcl-1siRNA2组与各对照组细胞比较,Mcl-1蛋白的表达显著下调（P<0.05）。而Mcl-1siRNA2组、Mcl-1siRNA4组与各对照组之间比较无明显差异性（P>0.05）。转染72h后,四个Mcl-1siRNA片段组与各对照组细胞比较,Mc1-1蛋白的表达均显著下调（P<0.05）。其中Mcl-1siRNA1在48h的抑制作用最好,达到96.1%。在两株细胞三个时间点中,空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异（P>0.05）。转染Mcl-1siRNA后可有效下调胃癌细胞Mcl-1蛋白的表达。结果显示,Mcl-1siRNA可特异性、高效地下调MCl-1基因的表达；不同的Mcl-1siRNA片段对Mcl-1基因表达的抑制作用不同；而相同的片段在不同时间点对Mcl-1基因表达的抑制作用也不同,总体上讲随着时间的延长对Mcl-1的表达抑制作用减弱。从抑制率跟稳定性来看,Mcl-1siRNA1片段的效果最好。我们选择Mcl-1siRNA1开展后面的实验。5.MTT检测结果：用MCl-1siRNA1转染胃癌细胞SGC7901和MGC-803。两株细胞转染24h、48h和72h后转染组与空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组相比较差异均显著（P<0.05）。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无明显差异性（P>0.05）。抑制MCl-1表达后,胃癌细胞增殖能力明显受到抑制。SGC790中各时间点的抑制率分别为21.4%、39.9%、31.3%;MGC-803中的抑制率分别为8.9%、21.6%、18.8%。转染48h后抑制率最高。6.转染48h后胃癌细胞SGC7901和MGC-803凋亡情况：空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组、Mcl-1siRNA1组中细胞凋亡率在SGC7901为2.56%±0.36%、2.79%±0.26%、2.35%±0.21%、26.66%±1.10%;在MGC-803为3.69%±0.37%、3.54%±0.47%、3.68%±0.55%、19.61%±1.66%。转染组的凋亡细胞明显增多,与各对照组比较差异显著（P<0.05）。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异性（P>0.05）。7.转染48h后细胞周期分布：空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组、Mcl-1siRNA1组S期细胞比例在SG7901分别为33.43%±2.80%、34.37%±1.21%、34.13%±3.95%、52.93%±1.11%,在MGC-803分别为25.40%±0.85%、26.03%±1.10%、24.63%±1.01%、57.17%±1.72%。siRNAl组S期细胞明显增多,同时,G0/G1期、G2/M期比例相应的减少,与各对照组比较差异显著（P<0.05）。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较无明显差异性（P>0.05）。8.侵袭实验显示,转染48h后,空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组和Mcl-1siRNA1组侵袭细胞个数在SGC7901中分别为51.33±5.51、49.00±3.61、50.33±3.51、24.00±3.51,而在MGC-803中分别为79.33±3.51、74.67±2.52、77.33±3.06、42.00±4.00。转染Mcl-1siRNA1组与各对照组比较有显著差异（P<0.05）。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异（P>0.05）。抑制MCl-1表达后对SGC7901细胞侵袭能力的抑制率为51.25%,对MGC-803细胞侵袭能力的抑制率为47.05%。9.迁移实验显示,转染48h后,空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组和Mcl-1siRN A1组迁移细胞个数在SGC7901分别为60.50±3.28、58.33±4.51、60.00±5.00、34.00±4.00,在MGC-803细胞中分别为108.00±3.61、110.67±4.04、109.33±4.51、76.33±3.51。转染Mcl-1siRNA1组与各对照组比较差异显著（P<0.05）。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异（P>0.05）。抑制MCl-1表达后对SGC7901细胞迁移能力的抑制率为43.80%,对MGC-803细胞迁移能力的抑制率为29.35%。结论1.胃癌细胞株SGC7901和MGC-803中存在Mcl-1基因的表达,可以用于siRNA抑制MCl-1基因的表达,进行Mcl-1基因在胃癌细胞生物学行为中的作用的研究。2.脂质体介导的Mcl-1siRNA转染胃癌细胞株SGC7901和MGC-803,可特异性、高效地下调Mcl-1基因的表达。不同的Mcl-1siRNA片段对MCl-1基因表达的抑制作用不同;而相同的片段在不同时间点对MCl-1基因表达的抑制作用也不同。总体上讲,随着时间的延长对Mcl-1的表达抑制作用减弱。说明,RNAi是一种抑制胃癌细胞Mcl-1基因表达的有效的方法。3.抑制Mcl-1表达,导致体外培养的胃癌细胞的增殖受到抑制、凋亡增加、细胞周期阻滞在S期、侵袭迁移能力受抑。表明,通过RNAi抑制Mcl-1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的方法。为完善胃癌的治疗方法、改善胃癌患者的预后,提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 胃癌细胞中Mcl-1基因表达的检查
• 材料与方法
• 实验结果
• 第二部分 Mcl-1特异性siRNA对胃癌细胞中Mcl-1基因表达的影响及有效片段的筛选
• 材料与方法
• 实验结果
• 第三部分 siRNA沉默Mcl-1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 致谢
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