成骨生长肽对体外培养的奶牛成骨细胞骨形成的影响

论文摘要

目的：观察不同浓度OGP对体外培养的奶牛成骨细胞成骨活性的影响。方法：无菌取出新生奶牛的肋骨采用组织块培养法获取成骨细胞进行原代、传代培养，取第二代细胞通过形态学观察、碱性磷酸酶染色等方法鉴定为较纯的成骨细胞后作为试验模型，将含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液配制成含4％牛血清白蛋白的不同浓度的OGP与第二代奶牛的成骨细胞共培养。采用MTT法观察OGP对成骨细胞增殖功能的影响（用波长490nm处的OD值表示）；氨基安替吡啉测酚法（金氏法）观察对成骨细胞分化功能的影响（用碱性磷酸酶活性表示）；放射免疫法观察对成骨细胞分泌骨钙素的影响（用放免活性单位-ng／mL表示）。RT-PCR法观察OGP干预下相关因子-骨钙素mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达影响。结果：采用组织块培养法，获得的细胞具有典型成骨细胞的形态特征，细胞碱性磷酸酶染色呈阳性率达94％以上，符合成骨细胞的生物学特性，表明培养的细胞为高纯度的成骨细胞。加OGP培养后测定细胞增殖的结果显示：不同浓度的OGP均能促进成骨细胞的增殖，在10-12～10-8mol／LOGP浓度范围内的促增殖作用呈现剂量-效应关系，与对照组相比，10-12mol／L试验组就可促进成骨细胞增殖，10-8～10-11mol／L试验组与对照组比较均有显著性差异（P<0．05），以10-10mol／L试验组最为显著（P<0．01），10-9mol／L试验组开始呈现下降趋势，随OGP浓度的增加其刺激作用不再增加。OGP对奶牛成骨细胞的增殖作用还存在时间-效应关系，随着作用时间的延长，吸光度值升高，作用至第5d时吸光度值最高，到第7d吸光度值有所下降。加入OGP培养5d后测定细胞培养液中碱性磷酸酶活性，结果显示：不同浓度的OGP在促进成骨细胞分化上与对照组比较差异显著（P<0．05），所不同的是OGP在对成骨细胞分化中表现出的是抑制作用，而且抑制作用呈现倒正态状，在抑制中呈现剂量双向性，在10-10mol/L时抑制作用显著。加入OGP培养5d后测定细胞培养液中骨钙素含量，结果显示：在不同浓度的OGP作用下与对照组相比较差异不显著（P>0．05），对细胞上清液中BGP起抑制作用，呈现剂量双向性，在10-10mol／L时抑制作用显著（P<0．05）。OGP作用15d后提取细胞RNA，进行RT-PCR检测骨钙素mRNA、Ⅰ型胶原mRNA，10-8、10-10、10-12mol／L试验组均能促进二者表达。结论：成骨生长肽虽然对成骨细胞分化作用不明显但是能增加奶牛成骨细胞骨钙素mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达，促进细胞增殖。因此，成骨生长肽具有调节奶牛成骨细胞增殖的功能，促进成骨，试验亦可说明奶牛动物试验可采用啮齿类动物作为试验动物模型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词汇表（ABBREVIATION）
• 前言
• 文献综述一 成骨生长肽的研究进展
• 1.成骨生长肽的发现简史
• 2.成骨生长肽的一级结构与活性成分
• 3.成骨生长肽的生物学活性
• 3.1 成骨生长肽与碱性磷酸酶
• 3.2 成骨生长肽与血清骨钙素
• 3.3 成骨生长肽与Ⅰ型胶原mRNA、BGPmRNA表达
• 4.成骨生长肽的功能
• 4.1 成骨活性
• 4.2 成骨生长肽促进骨折愈合的作用
• 4.3 有丝分裂原活性
• 4.4 成骨生长肽的促血生成作用
• 5.成骨生长肽的临床应用前景
• 5.1 成骨生长肽与骨质疏松
• 5.2 成骨生长肽在骨创伤中的应用
• 5.3 成骨生长肽在矫形外科手术中的应用
• 5.4 成骨生长肽在造血系统中的应用
• 文献综述二 成骨细胞及其在骨质疏松中的作用
• 1.成骨细胞
• 1.1 成骨细胞的来源
• 1.2 成骨细胞的骨形成机制
• 1.3 成骨细胞功能
• 2.影响成骨细胞发挥作用的主要因素
• 3.骨质疏松及其发生机理
• 3.1 骨质疏松症
• 3.2 骨质疏松发生的主要机理
• 3.3 骨质疏松的分类
• 4.体外成骨细胞的分离培养的应用与奶牛骨质疏松症
• 4.1 体外成骨细胞分离培养的应用
• 4.1.1 体外成骨细胞分离培养在骨组织工程中的应用
• 4.1.2 体外成骨细胞分离培养在探讨骨科用药机制中的应用
• 4.1.3 体外成骨细胞分离培养的其他应用
• 4.2 成骨细胞培养与奶牛骨质疏松症
• 5.与骨形成有关的生化指标
• 5.1 碱性磷酸酶
• 5.2 骨钙蛋白
• 5.3 Ⅰ型胶原
• 目的与意义
• 试验一 成骨细胞的培养与鉴定
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 试验动物
• 2.2 试验器材的处理
• 2.2.1 玻璃器皿的清洗
• 2.2.2 塑料器皿、胶塞、盖子等物品的清洗
• 2.3 主要试验仪器和设备
• 2.4 主要试验试剂及配制
• 2.5 研究方法
• 2.5.1 成骨细胞的原代培养
• 2.5.2 成骨细胞的传代培养
• 2.5.3 成骨细胞的鉴定
• 3.结果
• 3.1 形态学观察
• 3.2 ALP染色定性
• 3.3 矿化结节染色定性
• 4.讨论
• 4.1 奶牛成骨细胞及其体外培养方法的优化
• 4.2 成骨细胞的鉴定
• 试验二 成骨生长肽对体外培养奶牛成骨细胞的干预试验
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 试验动物
• 2.2 试验器材的处理
• 2.3 主要试验仪器和设备
• 2.4 主要试验试剂及配制
• 2.5 研究方法
• 2.5.1 细胞分组
• 2.5.2 细胞增殖的检测
• 2.5.3 细胞内ALP活性检测
• 2.5.4 成骨细胞骨钙素测定
• 2.5.5 半定量RT-PCR试验
• 2.6 统计学方法
• 3.结果
• 3.1 成骨生长肽对成骨细胞增殖活性的影响
• 3.2 成骨生长肽对成骨细胞上清液中ALP活性的影响
• 3.3 成骨生长肽对成骨细胞上清液中骨钙素的影响
• 3.4 成骨生长肽干预下对成骨细胞相关因子mRNA表达影响
• 4.讨论
• 4.1 MTF法检测细胞增殖
• 4.2 碱性磷酸酶与细胞分化
• 4.3 骨钙素与细胞分化
• 4.4 成骨生长肽对Ⅰ型胶原的影响
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录