论文摘要
原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）是精子或卵子的祖先细胞，是一种多能干细胞。由于原始生殖细胞可以直接将外源基因传给后代，故以其作为转基因载体生产转基因鸡具有广阔的前景。体外分离培养PGCs，并对其进行遗传操作，再将整合有外源基因的PGCs重新注入鸡胚血管中，就可获得性腺嵌合体，生产出稳定遗传的转基因后代。本实验从孵化5.5d的伊萨鸡胚生殖嵴中分离原始生殖细胞，经Ficoll密度梯度离心纯化PGCs细胞，通过PAS（过碘酸希夫试剂）和AKP（碱性磷酸酶）染色鉴定，其纯度可达70％。同时分离孵化5.5d的鸡胚性腺基质细胞作为饲养层，在添加多种生长因子（白血病抑制因子mLIF、成纤维细胞生长因子bFGF、白介素-11 IL-11、胰岛素样生长因子hIGF-Ⅰ、干细胞生长因子hSCF）的条件下培养PGCs细胞，探索其体外培养的最佳条件。本实验构建了pLenti6-eGFP慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19％。通过显微注射的方法，将转染外源基因的PGCs供体细胞，浓缩后注入孵化2.5d的受体鸡胚血液中，接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化至第8d。之后提取受体鸡胚基因组DNA进行PCR检测，结果显示：在检测的42只受体鸡胚中，有2只发生性腺嵌合，嵌合率为4.8％。本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法，不仅可以提供丰富的供体细胞来源，还为转基因鸡的成功制备创造条件。
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中文摘要英文摘要缩略语引言第一部分 文献综述第一章 鸡胚原始生殖细胞（PGCs）的生物学特性1 PGCs的形态和特性2 PGCs的起源3 PGCs的迁移规律3.1 PGCs的迁移路径3.2 PGCs的迁移机制4 PGCs的体外培养4.1 饲养层的重要性4.2 生长因子的影响5 PGCs的体外鉴定5.1 PGCs的形态学鉴定5.2 PAS特异性染色检测5.3 碱性磷酸酶活性（AKP）检测5.4 阶段特异性胚胎表面抗原（SSEA-1）6 PGCs的研究进展和应用前景第二章 转基因鸡研究进展1 转基因鸡的制备方法2 转基因鸡研究存在的问题3 本实验的目的与意义第二部分 实验研究第一章 鸡胚原始生殖细胞的体外培养1 实验材料2 实验方法3 实验结果3.1 饲养层细胞的制备3.2 PGCs的形态和染色3.3 PGCs的体外培养4 讨论与分析4.1 PGCs的分离与纯化4.2 PGCs的形态观察与染色鉴定4.3 PGCs的体外培养第二章 慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞1 实验材料2 实验方法3 实验结果3.1 慢病毒表达质粒的酶切鉴定3.2 慢病毒感染效率的检测3.3 慢病毒感染鸡胚PGCs4 讨论与分析第三章 性腺嵌合体鸡的制备和分子鉴定1 实验材料2 实验方法3 实验结果3.1 血管微注射对鸡胚成活率的影响3.2 嵌合体的PCR鉴定结果4 讨论4.1 血管微注射操作对胚胎生存的影响4.2 受体鸡胚的性腺嵌合率全文结论参考文献附录致谢
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标签：原始生殖细胞论文; 慢病毒论文; 转染效率论文; 嵌合体论文;
