论文摘要
近年来,随着基因转移技术的日趋成熟,肝癌的基因治疗成为生物科学和临床医学的研究热点之一。基因治疗的载体,以及载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性问题是限制基因治疗发展和临床应用的瓶颈。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的病毒载体和非病毒载体都存在无法克服的局限性。纳米粒基因转运载体是近年发展起来的一种新型的非病毒基因转运载体。它是将DNA、RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面耦联特异性的靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入胞内,实现安全有效的靶向性基因治疗。纳米粒材料的选择是成功进行纳米基因转运和治疗的关键。所选择的材料必须具有生物适应性和可降解型的,或者易于从体内排泄,而不产生有害的降解产物,且无免疫原性的物质,不会引起机体的免疫排斥反应。高分子生物降解材料制备的纳米颗粒具有稳定、无毒、无抗原性、生物相容性好、对所转运基因的表达有控释作用及对基因有保护作用等优点,是良好的纳米基因转运载体材料。研究证实,纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。本研究中结果显示,以氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒作为基因转运载体所形成的氨基硅烷化Fe3O4纳米粒/DNA复合物,能保护所携带的DNA免受核酸酶的降解和超声剪切作用。同时,本研究发现,在较低浓度下Fe3O4纳米颗粒与氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒对肝癌（HepG2）细胞无明显的细胞毒性,只在高浓度下才会表现出一定的细胞毒性作用。在体外基因转运中,该纳米颗粒可有效转运pEGFP-C1报道基因表达质粒进入HepG2细胞,其转运效率为39%,略高于相同条件下脂质体的转染效率,但无统计学差异（*P＞0.05,N=10）。在外加磁场的条件下氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率明显增强。在此基础之上,本研究以氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒作为基因转运载体,以重组人真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+）-p53作为治疗基因,对HepG2细胞的荷瘤小鼠模型进行以氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒作为基因转运载体在体内转运重组人真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+）-p53的转染,利用RT-PCR、Western blot等方法检测HepG2细胞中转染入的外源野生型p53的表达情况,结果发现,在HepG2细胞中成功导入了外源野生型p53基因,并能表达p53蛋白。本实验结合局部热疗研究基因治疗与局部热疗的协同效应及对荷瘤小鼠的肿瘤抑制情况,设计了对照组、局部热疗组、氨基硅烷化Fe3O4纳米粒作转导pcDNA3.1（+）-p53基因治疗组和联合治疗组4个实验组,结果显示,热疗和野生型p53基因治疗都能抑制荷肝癌裸鼠转移瘤的生长。热疗和野生型p53基因联合应用可达到较好的协同作用,比单一的热疗或基因治疗能更好的抑制肝癌转移瘤的生长。联合治疗组、基因治疗组、热疗治疗组的抑瘤率分别为84.07%,59.43%,47.19%。
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中文摘要英文摘要目录英文缩写注解第一部分 pcDNA3.1（+）-p53质粒的提取及鉴定一、前言二、材料与方法三、实验结果1.质粒pcDNA3.1（+）-p53的酶切鉴定2.质粒pcDNA3.1（+）-p53基因序列测定3.质粒pEGFP-C1的酶切鉴定4.紫外分光光度计测定质粒的纯度和含量四、讨论五、结论3O4磁性纳米粒的制备及表征'>第二部分 超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒的制备及表征一、前言二、材料与方法三、实验结果3O4纳米粒子形貌表征'>1.制备产物Fe3O4纳米粒子形貌表征3O4纳米粒子透射电镜TEM分析'>2.制备产物Fe3O4纳米粒子透射电镜TEM分析3O4纳米粒子晶体分析'>3.制备产物Fe3O4纳米粒子晶体分析3O4纳米粒子Zeta电位分析'>4.制备产物Fe3O4纳米粒子Zeta电位分析5.不同干燥温度对产物结构和性能的影响四、讨论五、结论3O4磁性纳米粒的氨基硅烷化修饰及与质粒DNA的连接'>第三部分 Fe3O4磁性纳米粒的氨基硅烷化修饰及与质粒DNA的连接一、前言二、材料与方法三、实验结果3O4纳米粒子的表征结果'>1.氨基硅烷化Fe3O4纳米粒子的表征结果3O4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果'>2.氨基硅烷化Fe3O4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果3O4纳米粒子对DNA的保护实验结果'>3.氨基硅烷化Fe3O4纳米粒子对DNA的保护实验结果3O4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验（MTT）'>4.氨基硅烷化Fe3O4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验（MTT）四、讨论五、结论3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1（+）-p53对人肝癌HepG2细胞的体外转染实验'>第四部分 氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1（+）-p53对人肝癌HepG2细胞的体外转染实验一、前言二、材料与方法三、实验结果3O4磁性纳米粒介导pEGFP-C1质粒体外转染HepG2细胞实验'>1.氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒介导pEGFP-C1质粒体外转染HepG2细胞实验3O4磁性纳米粒基因转导的影响'>2.外加磁场对氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒基因转导的影响3.HepG2细胞体外转染目的治疗基因pcDNA3.1（+）-p53后RT-PCR检测结果4.Western blot法检测各组细胞中p53蛋白的表达情况5.p53基因对HepG2细胞生长速度的影响6.p53基因对HepG2细胞集落形成的影响7.流式细胞仪检测凋亡四、讨论五、结论3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1（+）-p53基因体内转染实验及结合热疗对裸鼠肝癌模型治疗的观测'>第五部分 氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1（+）-p53基因体内转染实验及结合热疗对裸鼠肝癌模型治疗的观测一、前言二、材料与方法三、实验结果1.裸鼠肝癌HepG2移植瘤模型的建立3O4纳米粒-p53基因复合物治疗裸鼠肝癌HepG2移植瘤的疗效观察'>2.局部热疗联合瘤内注射氨基硅烷化Fe3O4纳米粒-p53基因复合物治疗裸鼠肝癌HepG2移植瘤的疗效观察3.肿瘤组织HE染色3O4纳米粒介导p53基因治疗组透射电镜观察图'>4.氨基硅烷化Fe3O4纳米粒介导p53基因治疗组透射电镜观察图5.各实验组VEGF表达的比较6.各实验组CD34的表达及MVD的结果比较7.VEGF与MVD的相关性分析四、讨论五、结论参考文献综述致谢攻读学位期间主要的研究成果
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氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米载体介导野生型p53基因治疗肝癌的实验研究
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