论文摘要
肝功能衰竭是各种严重肝病的终末期表现,肝移植是肝功能衰竭治疗的最有效手段,但供肝来源的紧缺限制了肝移植的广泛使用。以培养肝细胞为材料的体外生物人工肝支持系统有望为肝功能衰竭患者等待肝移植或通过自身肝再生恢复提供过渡的“桥梁”。迄今为止,几种新型的生物人工肝已进入Ⅱ～Ⅲ期临床试验,并取得了令人鼓舞的结果。生物人工肝的三大要素是生物反应器、肝细胞和体外装置,其中,生物反应器是生物人工肝的核心部分,其性能直接关系到生物人工肝支持治疗的效果和作用。故生物反应器的设计和构建在生物人工肝研究与临床应用中具有重要的意义。随着生物人工肝研究的不断深入,围绕着为肝细胞提供良好的生长、代谢环境和为肝功能衰竭患者血液或血浆与肝细胞相互作用、进行物质交换提供理想的场所两大基本功能,在传统中空纤维型生物反应器的基础上,一些新的生物反应器不断出现,归纳起来主要为四大类:中空纤维型、灌流式/支架型、细胞包裹/悬液型、平板式生物反应器。其中中空纤维型生物反应器具有较强的免疫阻隔和物质传输作用,但肝细胞培养效果较差,灌流式/支架型生物反应器具备良好的肝细胞培养效果,而缺乏免疫阻隔和灌流不均。如果能够将灌流式/支架型与中空纤维型生物反应器有效结合,可扬长避短,这种杂交型生物反应器尚未见研究报道。本实验设计和构建杂交型生物反应器,力求实现肝细胞培养、物质传输、免疫阻隔三者的完美结合,提高生物反应器的性能和肝支持效果,为生物人工肝治疗肝功能衰竭提供新的实验依据。本实验选择有代表性的6种半透膜材料进行肝细胞（L02细胞）培养,通过检测细胞LDH漏出量和DNA Ladder细胞凋亡评价膜材料的细胞毒性,观察各种膜材料上L02细胞的贴壁率、细胞活性、DNA总量、总蛋白合成和CYP1A2活性等,筛选出肝细胞相容性最佳的半透膜材料用于中空纤维制备。利用非对称性冷却成型技术制备单内皮层PES平板膜和中空纤维,采用多种显微镜观察制备的平板膜和中空纤维结构,着重分析L02细胞在PES平板膜和中空纤维上的形态、生长曲线、白蛋白合成、LDL摄取、生物转化等功能,以评价制备的PES平板膜和中空纤维对肝细胞粘附、生长、增殖和功能表达的支持效果。应用一步发泡技术制备聚氨酯多孔支架材料,并与商品化的壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯三维支架材料对比,根据材料的肝细胞相容性、孔隙率、孔径、和物理特性等,确定用于生物反应器构建的三维支架材料,在此基础上,进一步采用鼠尾胶原或纤维蛋白凝胶进行优化培养,以提高该支架材料对肝细胞培养的支持效果。在上述研究的基础上,构建PES中空纤维和聚氨酯多孔支架杂交的三维立体式生物反应器。利用血浆循环评价该反应器的物质传输能力;通过纤维蛋白凝胶进行反应器内肝细胞的凝胶化培养,观察反应器内培养肝细胞的形态和分布,检测凝胶化反应器内肝细胞功能的表达,以评价反应器的性能;采用体外人工肝实验评价生物反应器对重型肝炎病人血浆的肝支持作用。本实验的主要研究结果如下:1.在各种膜材料上培养L02细胞的LDH漏出量与对照组无显著差异,提取的细胞DNA电泳未见DNA Ladder。细胞在PES膜上的贴壁率显著高于CA、PVDF、PP、CNA膜,与对照组和PSF膜无显著差异,PSF膜显著低于对照组;PES膜上贴壁细胞数明显较CA和CNA膜多,形态典型。PES和PSF膜上细胞DNA总量与对照组无显著差异,显著高于CA、PP、CNA膜,PVDF膜上细胞DNA总量显著低于对照组;在7天的培养时间内,PES膜上和对照组的细胞活性最高,显著高于CA、PVDF、PP、CNA膜。PES膜上培养L02细胞合成的细胞总蛋白与对照组无显著差异,显著高于其它膜材料;各种膜材料上培养L02细胞CYP1A2活性均高于对照组。2.制备的PES平板膜和中空纤维的横截面由大量纵向排列的指状孔构成,指状孔开口于外表面形成有大量微孔的粗糙面,封闭于的内表面形成致密层和光滑面。PES膜上L02细胞的生长曲线典型,在8d的培养时间能增殖6至7倍,中空纤维上培养的L02细胞可长满中空纤维表面;细胞在PES膜和中空纤维上粘附呈多细胞聚集生长,可覆盖材料表面,部分细胞延伸入表面微孔内。PES膜和中空纤维上培养细胞LDH漏出量与对照无显著差异。PES膜和中空纤维上培养L02细胞的白蛋白合成量持续升高,在第8天反超对照组细胞;在DiI-Ac-LDL摄取实验中,PES膜和中空纤维上培养L02细胞内红色荧光强度与对照无明显差异,在戊醚试卤灵转化实验中,PES膜和中空纤维上培养L02细胞内红色荧光强度比对照组高。3.制备出高孔隙率和有弹性的聚氨酯多孔支架材料,壳聚糖易塌陷变形,聚乳酸-聚羟乙酸酯质地较硬,提示聚氨酯更容易与中空纤维组合。L02细胞在聚氨酯和壳聚糖支架材料内的细胞接种率显著高于聚乳酸-聚羟乙酸酯,壳聚糖内的细胞接种率最高;L02细胞在聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯内均粘附微孔壁生长,在聚氨酯内分布更均匀,在壳聚糖内呈多细胞聚集生长;聚氨酯和壳聚糖内培养L02细胞的活性和白蛋白合成量显著高于聚乳酸-聚羟乙酸酯,聚氨酯和壳聚糖之间无显著差异。鼠尾胶原被覆组和对照组的L02细胞均在聚氨酯材料微孔内贴壁生长,鼠尾胶原被覆组的贴壁细胞数量明显高于聚氨酯对照组,纤维蛋白凝胶组培养的L02细胞均匀分布在材料微孔内,呈多细胞球形体生长;纤维蛋白凝胶组L02细胞的活性在7d内显著升高,在3、5、7d均显著高于聚氨酯对照组和纤维蛋白凝胶组;纤维蛋白凝胶组L02细胞的白蛋白合成量逐渐升高,在培养的第5和7d显著高于鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组。4.以单内皮层PES中空纤维和聚氨酯材料为骨架构建出杂交型三维立体式生物反应器。在物质传输实验中,杂交型生物反应器内外腔总胆红素和白蛋白浓度达到平衡分别需10min和15min,与对照组无明显差异,凝胶化杂交型反应器内总胆红素和白蛋白浓度达到平衡较对照组延缓5min,但30min内能完全达到平衡,提示构建的反应器具有良好的物质传输能力,凝胶化对反应器物质传输的无显著影响。凝胶化培养反应器内肝细胞呈球形体生长,较对照组分布更均匀;反应器凝胶化培养可恢复肝细胞CYP3A4和UGT1A mRNA的表达;凝胶化反应器内肝细胞的白蛋白合成、尿素合成、氨清除率均持续稳定上升,在培养后期显著高于对照组,LDH漏出量较对照组更低,有较强的CYP1A2活性;凝胶化反应器内重型肝炎病人血浆循环实验发现,经6h的体外循环,病人血浆中总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、总胆汁酸、氨等的含量均显著降低。在循环病人血浆中ALT、ALP、GGT等酶无显著影响,但AST和LDH持续升高。以上结果提示:①在PES、PSF、CA、PVDF、PP、CNA等半透膜材料中,PES是肝细胞相容性最佳的半透膜材料,适宜用于生物反应器中空纤维的制备。②制备的PES平板膜和中空纤维具备单内皮层、指状孔、外表面粗糙、内表面光滑、非对称性的特点,能够较好的支持肝细胞的粘附、生长、增殖和功能的表达。③制备出高孔隙率有弹性的聚氨酯支架材料,与肝细胞有较好的细胞相容性,纤维蛋白凝胶能有效优化聚氨酯材料内肝细胞培养条件,提高培养肝细胞活性和功能的稳定表达。④成功的构建出杂交型三维立体式生物反应器,该反应器具有良好的物质传输能力,凝胶化生物反应器能够培养大量、高密度、合成功能和生物转化功能稳定的肝细胞,该反应器能有效清除重型肝炎病人血浆内胆红素、氨、胆汁酸等。据此推测,该生物反应器有可能对重型肝炎患者的治疗具备一定的肝支持效果。
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