小麦抗黄矮病相关基因片段的克隆

论文摘要

小麦黄矮病（wheat yellow dwarf disease,WYD）是小麦的主要病害之一,由蚜虫传播的大麦黄矮病毒（BYDV）引起。小麦黄矮病可引起小麦严重减产,因此防治小麦黄矮病对于小麦的稳产具有重要意义。目前还没有能够有效地防治小麦黄矮病发生的化学药剂,培育抗病品种是防治黄矮病的有效方法。本研究以从小麦品种间杂交组合“川35050/山农483”的F7株系中分离出的抗病和感病株系（近等基因系）为材料,利用改进的DDRT-PCR技术和同源序列克隆法对抗感材料中的差异基因进行分离,以期找到抗小麦黄矮病相关基因,并对这些差异表达的cDNA和DNA片段进行克隆、测序和分析。主要结果如下:（1）以感、抗小麦黄矮病的2个近等基因系为材料,利用mRNA差异显示技术进行PCR扩增。为增强抗病基因片段的筛选,我们根据抗病基因保守结构域序列设计7条简并或特异引物,并将7条引物代替5′端的随机引物进行差异显示扩增。银染显色后发现只有SP5L引物和锚定引物组合能扩增出条带,我们从扩增的条带中选择回收有明显差异且重复性好的cDNA片段14条。将14条差异条带进行克隆测序后,获得4条差异序列,分别命名为Rbdv1～Rbdv4（GenBank注册号:EU267934～EU267937）。经BlastN比对,这些序列与大麦在幼苗、叶、穗等不同器官生长过程中表达的cDNA克隆有95%的同源性,并与编码水稻细胞分裂蛋白48-A的基因和编码拟南芥细胞分裂蛋白48-E的基因的同源性分别为90%、81%。（2）利用cDNA末端快速扩增技术（3′-RACE）扩增Rbdv1的3′端的序列,获得带有典型的poly（A）尾巴的一条序列,命名为A1,GenBank注册号为EU267938。对A1的氨基酸序列进行分析,发现该片段中包含一个磷酸结合环（P-Loop）,P-Loop是抗病基因保守结构域NBS的其中一个区域。经BlastN同源性比对分析,该片段与不同植物（如拟南芥、水稻等）中的一种细胞分裂周期相关的蛋白基因CDC48（cell division protein 48）同源性很高。CDC48是AAA-ATPase基因家族成员之一,其主要功能就是ATP结合位点（ATP binding site）。利用DNAstar软件对本文所获得RACE片段（A1）以及N、L6、RPM1、Pib、RPP8等已知的植物抗病基因的P-Loop区域序列之间在氨基酸水平上进行聚类分析。结果表明,虽然都具有相同的抗病基因的特征保守结构域,但该片段却与以上抗病基因的相关蛋白并不能聚为一类,亲缘关系较远,可能编码一新的抗病基因蛋白。（3）利用抗病基因同源序列克隆法,由7对根据抗病基因的保守结构域设计的简并或特异引物对抗、感黄矮病株系进行PCR扩增,结果只有SP5引物对扩增获得一个RGA片段。将该RGA片段进行克隆测序后,得到一532bp序列。经NCBI GenBank进行BlastN同源性比较,结果显示,RGA序列与小麦（登录号:AF320845）、高粱（登录号:AF052396）等NBS-LRR类抗病同源序列具有较高的同源性,分别为99%、100%,与偏凸山羊草抗病基因V6（登录号:AF158635）及Cre3抗病类似蛋白Cre3-1、Cre3-2（登录号:AF281284、AF281285）的同源性均为100%。（4）利用TAIL-PCR扩增该RGA片段的侧翼序列,结果将该序列在5′和3′分别方向上延伸了337bp和726bp,用DNAMAN软件Sequence Assembly进行拼接获得长1563bp的序列。分析其氨基酸序列可知,该序列包含一个361aa的通读阅读框,该阅读框内包含NBS完整的7个区域:I,P-Loop;II,Kinase-2a;III,Kinase-3a;IV,GLPL（A/L）A;V,RCFAYCS;VI,EGF和VII,HDL。与原RGA对比显示,TAIL-PCR成功地将RGA在原来序列基础上分别将上游和下游的P-Loop和HDL扩增出来。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 小麦黄矮病及其抗源
• 1.2 植物抗病反应的分子机理
• 1.2.1 基因对基因假说
• 1.2.2 R 基因与Avr 基因互作的模式
• 1.2.3 病原菌无毒基因
• 1.2.4 植物的主动防卫反应
• 1.2.5 植物的防卫基因
• 1.3 植物抗病基因克隆
• 1.3.1 植物中已克隆的抗病基因
• 1.3.2 植物抗病基因的结构特征
• 1.3.3 植物抗病基因克隆的方法
• 1.3.4 植物抗病基因同源序列
• 1.4 基因全长序列的获得
• 1.4.1 cDNA 末端快速扩增技术
• 1.4.2 TAIL-PCR 技术
• 1.5 本研究意义、研究内容、预期目标
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 菌种和表达载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 基因组总DNA 的提取
• 2.2.3 总RNA 的提取及纯化
• 2.2.4 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.5 PCR 扩增
• 2.2.6 电泳检测
• 2.2.7 差显法获得的差异条带的回收、二次扩增及检测
• 2.2.8 RGA 特异性扩增的PCR 产物的回收
• 2.2.9 差异片段的克隆
• 2.2.10 利用RACE 方法扩增cDNA 末端序列
• 2.2.11 利用TAIL-PCR 扩增RGA 侧翼序列
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦抗黄矮病基因相关cDNA 片段的克隆
• 3.1.1 总RNA 的提取及第一链cDNA 的合成
• 3.1.2 m RNA 差异显示
• 3.1.3 差异条带的二次扩增
• 3.1.4 重组质粒的鉴定
• 3.1.5 测序结果与分析
• 3.1.6 利用RACE 技术获得3′末端序列
• 3.2 小麦抗黄矮病RGA 的克隆
• 3.2.1 简并或特异引物的PCR 扩增与分析
• 3.2.2 RGA 片段的回收与克隆及阳性克隆的鉴定
• 3.2.3 测序结果与分析
• 3.2.4 TAIL-PCR 扩增RGA 侧翼序列
• 4 讨论
• 4.1 利用差显法克隆抗病基因相关片段
• 4.2 本研究获得的RGA 与抗病基因的关系
• 4.3 利用TAIL-PCR 扩增RGA 的侧翼序列
• 5 结论
• 5.1 差显法
• 5.2 同源序列克隆法
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发论文表情况