水蛭抗凝血活性成分及注射用水蛭（冻干粉针）的研究

论文摘要

水蛭是一味传统的抗凝血中药。前人已经对一些品种水蛭的化学成分、药理作用及临床应用进行了报道，这些都为进一步研究水蛭提供了依据。过去，人们认为只有吸血的水蛭才有抗凝血活性，只有新鲜的水蛭唾液中才存在抗凝血物质。但是大量的临床实践证明不吸血只吸食贝壳和蛤蚧的蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）抗凝血作用非常好，而且该品种水蛭的干燥体是国内水蛭市场的主流品种，也是临床应用的主要水蛭品种。但目前为止，国际上对其化学成分仍没有研究报道，其制剂研究也不成熟，因此，这方面具有很大的研究和开发价值。本研究即从抗凝血活性成分、药材提取工艺及冻干粉针制剂三个方面对蚂蟥（Whitmania pigra）进行了研究：首先，对水蛭的资源品种、化学成分、药理作用、制剂研究及临床应用等方面进行了详细的综述。以血浆复钙时间为指标，对水蛭干燥体的抗凝血活性成分进行了追踪分离纯化。首先从五种溶剂系统中筛选出提取抗凝血活性成分的最佳溶剂系统：试剂Ⅰ—水（40％，v／v）。然后对40％试剂Ⅰ的提取物进行乙醇分级沉淀，得到60％和85％两个乙醇沉淀物，并确定85％的乙醇沉淀为水蛭的抗凝血活性部分。在此基础上，通过阴离子交换色谱、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝胶滤过色谱及反相高压液相色谱分离，从该活性部分中分离得到三个活性多肽。其中化合物1和2在自然条件下互相转化，因此只测定了它们的分子量，分别为7100Da和5531Da。采用HPLC法和SDS-PAGE法确定化合物3为一纯化合物，采用MALDI-TOF-MS法测定出其分子量为8608Da，并测定了其氨基酸组成。确定化合物3为首次分离得到的抗凝血多肽，由于该物质代表了蚂蟥（Whitmania pigra）40％的抗凝活性，因此将其命名为蚂蟥多肽（whitmanin）。以水蛭药材中的whitmanin为指标性成分，通过正交试验考察了试剂Ⅰ的浓度、试剂Ⅰ的用量、提取时间和提取次数4个因素，优化了原料药材水蛭有效成分的提取工艺。确定水蛭药材的最佳提取工艺为：40％的试剂Ⅰ（4倍量）提取4次，每次24h。并通过进一步的单因素试验，确定水蛭提取液的精制工艺为：用60％乙醇沉淀除去杂质后，用85％的乙醇沉淀出抗凝血活性部分，后者的水溶液用0.22μm的微孔滤膜滤过，干燥，即得水蛭活性部位（LI）。采用体外血栓法、纤维蛋白平板法及全血血块法，观察了水蛭活性部位的抗血栓作用；采用家兔血浆复钙时间法、凝血酶时间法及凝血酶原时间法，观察了LI的抗凝血作用。结果表明LI高剂量、中剂量和低剂量组均能明显溶解体外血栓（P＜0.001）、纤维蛋白平板（P＜0.001）和全血凝块（作用显著）；并能显著延长家兔血浆复钙时间、凝血酶时间和凝血酶原时间（P＜0.001）。从而证明本研究所得LI具有较强的抗血栓和抗凝血作用。此外，安全性实验结果表明：LI静脉给药毒性较低，豚鼠无过敏反应，体外无溶血现象，连续给药未发现有出血趋向，证明LI无明显毒副作用。以冻干粉针的成型性、外观色泽、再溶解性、澄明度为评价指标，选择了辅料ML、辅料MR、辅料ME、辅料GS及辅料MHP五种辅料，考察了辅料的种类、辅料的用量及预冻时间对制剂成型性、外观色泽的影响。最终确定4～8％的辅料ML为本冻干制剂的最佳冻干辅料；为了确保制剂在规定的pH值范围内稳定，筛选出0.9％的辅料ME为本制剂的保护剂；以whitmanin为指标，考察了辅料及灭菌方法对有效成分whitmanin含量的影响，确定了注射用水蛭（冻干粉针）的处方及制剂工艺。建立了采用HPLC法对水蛭药材、活性部位及注射用水蛭（冻干粉针）中指标性成分whitmanin的含量测定方法，根据多批次样品的检定结果，制定了水蛭药材、活性部位及注射用水蛭（冻干粉针）中指标性成分whitmanin的含量限幅。对注射用水蛭（冻干粉针）进行了稳定性试验研究，包括影响因素试验、加速试验和长期留样观察试验，初步确定了注射用水蛭（冻干粉针）的储存条件。

论文目录

缩略语说明

中文摘要

ABSTRACT

第一章水蛭的研究概况

1.1 水蛭的资源

1.2 水蛭的化学成分

1.3 水蛭的药理作用

1.4 水蛭的临床研究

1.5 水蛭的制剂研究

第二章水蛭抗凝血活性成分的研究

2.1 实验材料

2.1.1 药品与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 实验动物

2.2 蛋白质含量测定方法——Lowry法（即Folin法）

2.2.1 试剂的配制

2.2.2 蛋白质含量测定

2.3 活性检测方法——血浆复钙时间测定法

2.4 抗凝血活性成分的提取及分离

2.4.1 抗凝血活性成分提取溶剂系统及分级分离方法

2.4.2 抗凝血活性成分的提取及对提取物的分析

2.5 抗凝血活性成分的追踪分离

2.5.1 阴离子交换树脂柱色谱

2.5.2 Sephadex G-25柱色谱

2.5.3 Sephadex LH-20柱色谱

2.5.4 Fr.Ⅰ-2-1的分离纯化

2.5.5 Fr.Ⅰ-2-3的分离纯化

2.6 化合物的性质分析

2.6.1 化合物1的HPLC分析

2.6.2 化合物2的HPLC分析

2.6.3 化合物3的性质分析

2.8 小结与讨论

2.8.1 本章小结

2.8.2 试验讨论

第三章水蛭药材的提取精制工艺研究

3.1 实验材料

3.1.1 药品与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 whitmanin含量测定方法的建立

3.3 水蛭药材提取工艺研究

3.3.1 提取溶剂的选择

3.3.2 药材提取正交试验设计

3.3.3 提取工艺正交试验结果

3.4 水蛭提取液精制工艺研究

3.4.1 乙醇分步沉淀

3.4.2 微孔滤膜滤过

3.4.3 精制结果

3.4.4 精制工艺的确定

3.5 小结与讨论

3.5.1 小结

3.5.2 试验讨论

第四章水蛭活性部位的药理研究

4.1 实验材料

4.1.1 药品与试剂

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验动物

4.2 统计学处理方法

4.3 LI的纤溶和抗凝血活性

4.3.1 LI对体外血栓的溶解作用

4.3.2 LI对纤维蛋白平板的溶解作用

4.3.3 LI对全血凝块的溶解作用

4.3.4 LI对血浆复钙时间的影响

4.3.5 LI对家兔血浆凝血酶时间的影响

4.3.6 LI对家兔血浆凝血酶原时间的影响

4.4 制剂安全性试验

4.4.1 溶血试验

4.4.2 过敏试验

4.4.3 最大耐受量试验（急性毒性试验）

4.5 小结与讨论

第五章水蛭药材及水蛭活性部位的含量测定

5.1 实验材料

5.1.1 药品与试剂

5.1.2 实验仪器

5.2 水蛭药材中whitmanin的含量测定

5.2.1 方法学考察

5.2.2 含量测定

5.3 水蛭活性部位中whitmanin的含量测定

5.3.1 方法考察

5.3.2 含量测定

5.4 小结与讨论

第六章注射用水蛭（冻干粉针）的处方工艺研究

6.1 实验材料

6.1.1 药品与试剂

6.1.2 实验仪器

6.2 处方筛选

6.2.1 剂量的确定

6.2.2 冻干体积的确定

6.2.3 冻干支持剂品种的选择

6.2.4 辅料ML用量的选择

6.2.5 预冻液pH值的确定

6.2.6 处方工艺的确定

6.3 冻干工艺优化

6.3.1 最低共熔点的测定

6.3.2 预冻时间的考察

6.3.3 冻干曲线的考察

6.4 冻干过程中辅料对whitmanin含量的影响

6.5 灭菌方法对whitmanin含量影响

6.6 注射用水蛭（冻干粉针）的稳定性考察

6.6.1 影响因素试验

6.6.2 加速试验

6.6.3 室温留样考察

6.7 小结与讨论

第七章注射用水蛭（冻干粉针）的含量测定

7.1 实验材料

7.1.1 药品与试剂

7.1.2 实验仪器

7.2 注射用水蛭（冻干粉针）中whitmanin的含量测定

7.2.1 方法考察

7.2.2 含量测定

7.3 小结与讨论

结论

全文讨论

参考文献

发表论文情况

致谢

水蛭抗凝血活性成分及注射用水蛭（冻干粉针）的研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢